Сигнальный путь фосфоинозитид-3-киназа (PI3K) / протеинкиназа B (AKT) / мишень рапамицина млекопитающих (mTOR) играет ключевую роль в регуляции таких клеточных процессов, как пролиферация и метаболизм, при этом киназа mTOR выступает в качестве его центрального эффектора [1, 2]. Нарушение регуляции этого пути вовлечено в широкий спектр патологий — от прогерии и туберозного склероза до неврологических расстройств и рака, включая рак молочной железы, для которого гиперэкспрессия mTOR является одним из ключевых механизмов прогрессии [1, 3–5]. В связи с этим изучение механизмов передачи сигнала mTOR вызывает значительный интерес в различных областях науки, включая онкологию, исследования старения и нейробиологию [6–8].

Столь важная роль выдвигает mTOR в качестве приоритетной мишени для разработки терапевтических стратегий, направленных на нормализацию гомеостаза данного сигнального пути, и это направление активно разрабатывается научным сообществом [9]. В нашем предыдущем исследовании мы продемонстрировали, что miR-162a подавляет пролиферацию и жизнеспособность клеток остеосаркомы, предположительно, за счет ингибирования экспрессии гена mTOR [10]. Однако отсутствие надежного метода оценки экспрессии mTOR не позволило напрямую верифицировать данный механизм, что послужило стимулом для разработки описываемой тест-системы.

Высокий интерес к изучению регуляции mTOR и его функций обусловливает потребность в надежных методах оценки его активности. Традиционные подходы, такие как вестерн-блоттинг [11] и люминесцентная микроскопия [12], несмотря на свою достоверность, отличаются высокой стоимостью, сложностью исполнения и зависимостью результатов от квалификации оператора.

Альтернативой прямому измерению уровня белка служит оценка экспрессии соответствующего гена путем количественного определения мРНК методом ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР-РВ) с использованием референсных генов. В качестве последних, как правило, выступают так называемые гены «домашнего хозяйства», характеризующиеся стабильной экспрессией в большинстве типов клеток как в норме, так и при патологии. Примерами таких генов служат гены глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH), бета-актина (ACTB), бета-2-микроглобулина (B2M), TATAсвязывающий белок (TBP) и рибосомный белок P0 (RPLP0) [13, 14].

В предложенной ранее мультиплексной ПЦР-тест-системе для анализа экспрессии mTOR [15] использовались референсные гены TBP и RPLP0, относящиеся к числу наиболее стабильных из известных на сегодняшний день [14]. Однако фундаментальным недостатком дизайна этой системы является перекрывание последовательностей зонда и одного из праймеров для гена TBP, что ставит под сомнение надежность получаемых с ее помощью результатов и подчеркивает необходимость создания корректно сконструированной альтернативы [13, 15, 16].

Целью настоящей работы стали разработка и валидация новой мультиплексной тест-системы на основе ОТ-ПЦР-РВ для относительного количественного анализа экспрессии гена mTOR с нормализацией на референсные гены TBP и RPLP0.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

In silico дизайн и анализ ПЦР-тест-системы

Последовательности мРНК целевых генов (в формате FASTA) были получены из базы данных Nucleotide NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/). Транскрипты были аннотированы с использованием инструмента Assemble by CDS в программном обеспечении Geneious Prime 2019.2.1 (Biomatters Ltd., США). Праймеры и зонды сконструированы с помощью веб-сервиса PrimerQuest Tool (Integrated DNA Technologies, Inc., США; https://www.idtdna. com/pages/tools/primerquest). Для дизайна праймеров использовали следующие критерии отбора [17]:

• специфичность — праймеры комплементарны уникальному участку гена-мишени;
• длина около 20 нуклеотидов;
• GC-состав (доля гуанина и цитозина) около 50%;
• наличие не менее одной пары G/C на 3'-конце каждого праймера;
• отсутствие комплементарных участков между праймерами, исключающее образование димеров;
• температура плавления (Tm) праймеров в диапазоне 55–65 °C.

К зондам предъявляли следующие требования: – длина около 20 нуклеотидов;

• GC-состав (доля гуанина и цитозина) около 50%;
• отсутствие участков с четырьмя и более последовательными повторами G или C (поли-G/поли-C участков);
• зонд располагается как можно ближе к праймерам, но не пересекается с ними;
• Tm зонда должна превышать Tm праймеров на 8–10 °C.

Анализ специфичности праймеров, их расположения относительно экзон-интронной структуры («flanking» и «spanning») был выполнен в программе Geneious Prime 2019.2.1 с использованием алгоритма BLAST. Образование димеров праймеров проверяли с помощью веб-сервиса OligoAnalyzer Tool (Integrated DNA Technologies, Inc., США; https://www.idtdna.com/pages/tools/oligoanalyzer) [17].

Валидация ПЦР-тест-системы in vitro

Клеточная линия

В исследовании использовали линию стромальных клеток костного мозга человека SCP-1, полученную из Коллекции клеточных культур Уральского государственного медицинского университета (Екатеринбург, Россия). Клетки культивировали во флаконах T-25 (Sarstedt, Германия) с адгезивным покрытием в среде, содержащей 94% базальной среды LoSera (HiMedia, Индия), 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (HiMedia, Индия), 0,01% L-глутамина (Servicebio, Китай) и 0,01% (1 : 1 : 1) раствора пенициллина, стрептомицина и амфотерицина В (Servicebio, Китай), в CO₂-инкубаторе (Panasonic (Sanyo) MCO-15A, Япония) при 5% CO₂ и 37 °C [10]. По достижении 90–100% конфлюэнтности клетки пассировали: удаляли использованную среду, дважды промывали сбалансированным солевым раствором Хэнка (HBSS) без ионов Ca и Mg (Servicebio, Китай), затем добавляли 2,5 мл 0,25%-го раствора трипсин-ЭДТА (Servicebio, Китай). Раствор удаляли через 10 с экспозиции. Флакон помещали в CO₂-инкубатор на 1 мин 30 с. После добавления свежей среды с сывороткой отслоившиеся клетки собирали, центрифугировали при 350 g в течение 3 мин, ресуспендировали и распределяли по новым флаконам в соотношении 1 : 3 [18]. Для данного исследования готовили суспензию клеток, как описано выше, и подсчитывали клетки в камере Горяева с использованием метода исключения трипанового синего.

Выделение нуклеиновых кислот

Для выделения тотальной РНК, содержащей фракцию мРНК, суспензию клеток (1 млн клеток/мл) помещали в пробирку Eppendorf объемом 1,5 мл и титровали двукратными разведениями в физиологическом растворе для получения образцов с концентрациями 1 млн, 500 тыс., 250 тыс., 125 тыс. и 62,5 тыс. клеток/мл. РНК выделяли из всех разведений для расчета аналитических параметров ПЦР-теста.

Выделение РНК из образцов клеточных культур проводили с использованием набора реагентов «Проба-НК» («ДНК-Технология», Россия) согласно инструкции производителя. После выделения тотальную РНК из суспензии 1 млн клеток/мл также последовательно двукратно разводили в физиологическом растворе для получения образцов с концентрациями матрицы 1, 1 : 2, 1 : 4, 1 : 8 и 1 : 16. Все варианты концентраций РНК-матрицы использовали для амплификации с целью валидации ПЦРтеста и расчета эффективности ПЦР.

Амплификация

Для анализа специфичности продукта амплификации было выполнено 10 отдельных технических повторов ОТ-ПЦР-РВ для каждого гена с использованием наборов реагентов «BioMaster RT-qPCR SYBR Blue» («Биолабмикс», Россия). Использовали неразведенную РНК-матрицу из суспензии 1 млн клеток/мл. Праймеры и зонды, соответствующие разработанным последовательностям, были синтезированы в ООО «ДНК-синтез», Россия. Согласно протоколу производителя, реакционные смеси готовили из 12,5 мкл «Реакционного буфера» (содержащего смесь дНТФ, ионы Mg и SYBR Green), 1 мкл «Реакционной смеси» (содержащей генетически модифицированную обратную транскриптазу вируса лейкоза мышей Молони и рекомбинантную Taq-ДНК-полимеразу, инактивированную специфическими моноклональными антителами), 5 мкл смеси с зондом, прямым и обратным праймерами (каждый по 0,12 мкмоль/л, 3 пмоль/реакция) и 6,5 мкл РНКматрицы. Конечный объем реакции составлял 25 мкл.

Дополнительно было выполнено 10 мультиплексных технических повторов (амплификация целевого гена и нормализаторов в одной пробирке) с использованием наборов реагентов «BioMaster RT-qPCR» («Биолабмикс», Россия). Реакционные смеси готовили, как описано выше, за исключением того, что реакционный буфер не содержал интеркалирующего красителя. Детекцию продуктов амплификации проводили с помощью электрофореза в горизонтальном агарозном геле.

Для оценки аналитических характеристик (эффективности, чувствительности и воспроизводимости) использовали схему разведений, описанную в разделе «Выделение нуклеиновых кислот». Эта схема включала как преаналитические (разведения клеток), так и аналитические (разведения РНК-матрицы) переменные, что позволило одновременно оценить эффективность амплификации, аналитическую чувствительность и техническую воспроизводимость. Все полученные образцы РНК — из пяти различных концентраций клеток и четырех серийных разведений — были проанализированы в трех повторах с использованием описанного ниже мультиплексного протокола ОТ-ПЦР-РВ. Было включено три повтора отрицательного контроля. Этот дизайн в общей сложности дал 27 индивидуальных реакций (девять уникальных типов образцов × три повтора) (рис. 1). Результаты этих 27 технических повторов сформировали основной набор данных для всех последующих расчетов эффективности ПЦР, стабильности референсных генов и технической вариабельности.

Протокол амплификации состоял из обратной транскрипции в течение 30 мин при 45 °C, начальной денатурации в течение 5 мин при 95 °C с последующими 45 циклами денатурации (15 с при 95 °C) и отжига праймеров (30 с при 68 °C). Стадия элонгации была исключена из протокола амплификации, чтобы ограничить амплификацию геномной ДНК [19]. Для детекции продуктов амплификации mTOR, RPLP0 и TBP в реальном времени были выбраны каналы флуоресценции FAM, HEX и ROX соответственно.

Детекцию в режиме реального времени проводили по значению Crossing Point (Cp), которое рассчитывается программным обеспечением прибора, как номер цикла, соответствующий максимуму второй производной кривой роста флуоресценции [20]. Поскольку данное исследование было сфокусировано на относительном количественном анализе экспрессии генов с использованием сравнительного метода, внешние калибровочные кривые не использовались одновременно с экспериментальными образцами. Результат считали валидным, если значение Cp детектировалось до 31-го цикла амплификации. Выбор данного порога обоснован экспериментально: при использовании протокола, включавшего стадию элонгации, начиная с 31 цикла в реакциях наблюдалось появление дополнительных продуктов амплификации, которые при электрофоретическом анализе соответствовали по длине фрагменту, амплифицированному с матрицы геномной ДНК (574 п.н., размер интрона). Исключение стадии элонгации из протокола позволило устранить данную неспецифическую амплификацию, и все сигналы, детектируемые после 31 цикла, более не наблюдались. Таким образом, порог в 31 цикл был установлен как граница, за которой гарантированно отсутствует вклад от амплификации геномной ДНК.

Все постановки выполняли на амплификаторе «ДТпрайм» («ДНК-Технология», Россия) с программным обеспечением производителя.

Электрофорез в агарозном геле

2,5%-й агарозный гель готовили разбавлением 2,5 г порошка агарозы (Helicon, Россия) в 100 мл 1× TBE буфера («Биолабмикс», Россия) с добавлением 3 мкл бромистого этидия (Servicebio, Китай). Электрофорез проводили при 100 В в горизонтальной камере для электрофореза SubCell GT Cell (Bio-Rad, США) в течение 40 мин. Результаты анализировали на УФ-трансиллюминаторе (Vilber, Франция) с использованием маркера ДНК 10–25 (Servicebio, Китай). Изображения фиксировали в цифровом формате и обрабатывали в Adobe Photoshop CC 26.11 (Adobe Inc., США).

Статистический анализ

Значение экспрессии определяли на основе значения Cp с использованием формулы «Fold Change» (FC), представленной Livak и Schmittgen [22]. Формула имела следующий вид:

FC = 2–ΔCp, ΔCp = Cptarget — Cpreference ,

где Cp_target — значение Cp целевого гена, а Cp_reference — значение Cp нормализатора.

Для анализа значение ΔCp рассчитывали с использованием каждого нормализатора по отдельности (RPLP0 или TBP), а также с использованием среднего геометрического значений Cp обоих нормализаторов в качестве комбинированного референсного значения.

Эффективность ПЦР для гена mTOR и референсных генов оценивали с помощью линейной регрессии зависимости значения Cp от log₂ клеточного эквивалента (CE). Этот показатель представляет собой теоретическое количество клеток, которому соответствует количество РНК, внесенной в реакцию, с учетом разведения как исходной клеточной суспензии, так и выделенной РНК. Корреляцию между CE в образце и значением Cp оценивали с использованием коэффициента корреляции Спирмена (ρ, считали статистически значимым при p < 0,05).

Эффективность амплификации для каждого гена рассчитывали исходя из угла наклона (b) линии линейной регрессии, построенной для зависимости значения Cp от log₂ CE.

Регрессионный анализ дал следующее уравнение для каждого гена:

 y = a – b ⋅ x,

где y — предсказанное значение Cp, a — пересечение с осью Y, b — наклон линии регрессии, а x — log₂(N), где N — рассчитанный CE.

CE рассчитывали как:

CE = начальная концентрация клеток ÷ разведение клеток ÷ разведение матрицы.

Для оценки стабильности референсных генов анализировали распределение уровня экспрессии гена mTOR, нормализованного на каждый из этих генов (показатель FC). Распределение описывали с помощью медианы и интерквартильного размаха (25-й и 75-й процентили).

Техническую вариабельность показателя FC для гена mTOR, рассчитанного с использованием одного или нескольких референсных генов, оценивали, анализируя распределение значений коэффициента вариабельности. Полученное распределение описывали с помощью медианы и интерквартильного размаха (25-й и 75-й процентили). Данный коэффициент для каждого образца вычисляли по следующей формуле:

значение вариабельности = 1 – (mTOR FC образца / среднее mTOR FC).

Значения относительной экспрессии гена mTOR (FC) были рассчитаны с использованием трех различных стратегий нормализации: по отдельности на гены RPLP0 и TBP, а также на среднее геометрическое их значений.

Весь анализ и построение графиков выполняли в среде R, версия 4.5.2.

РЕЗУЛЬТАТЫ

In silico дизайн и анализ ПЦР-тест-системы

Во избежание амплификации геномной ДНК при разработке олигонуклеотидов руководствовались двумя подходами: интрон-перекрывающим (flanking) и экзонперекрывающим (spanning). В первом случае праймеры подбирались к последовательностям разных экзонов, фланкирующих крупный интрон; во втором — один из праймеров или гидролизный зонд перекрывал границу сплайсинга двух соседних экзонов.

Для in silico верификации соответствия олигонуклеотидов указанным критериям были загружены нуклеотидные последовательности генов mTOR (NM_004958.4), RPLP0 (NM_001002.4) и TBP (NM_003194.5) в формате FASTA. В качестве референсных использовали последовательности хромосом 1 (NC_000001.11), 12 (NC_000012.12) и 6 (NC_000006.12), несущих целевые гены. Аннотация хромосомных последовательностей позволила установить экзон-интронную структуру исследуемых локусов.

На основе полученных данных об экзонной структуре была проведена оценка праймеров и зондов для генов mTOR и RPLP0, описанных ранее [16]; эффективность данных была подтверждена. Для гена TBP разработано 10 наборов праймер–зонд, из которых отобрана наиболее специфичная комбинация. Последовательности и параметры олигонуклеотидов представлены в таблице (таблица).

Предложенные стратегии нормализации и дизайна олигонуклеотидов были верифицированы in silico. Для генов mTOR и RPLP0 подтверждено фланкирование праймерами экзон-экзонных границ (экзоны 21–22 и 2–3 соответственно, стратегия flanking), а для гена TBP — перекрывание зондом интрона между экзонами 5 и 6 (стратегия spanning), что гарантирует отсутствие амплификации геномной ДНК. Согласно референсным последовательностям NCBI (NM_004958.4, NM_001002.4, NM_003194.5), праймеры и зонды локализованы на CDS следующим образом: для mTOR — прямой праймер 3381– 3402, зонд 3411–3435, обратный праймер 3437–3464; для RPLP0 — прямой праймер 95–115, зонд 181–205, обратный праймер 224–243; для TBP — прямой праймер 863–882, зонд 902–926, обратный праймер 930–951.

Кроме того, анализ межпраймерных взаимодействий не выявил стабильных димерных структур, о высокой специфичности разработанных систем.

Валидация ПЦР-тест-системы in vitro

При оценке специфичности продуктов амплификации во всех исследованных образцах (10 отдельных и 10 мультиплексных технических повторов для каждого гена) детектировался один четкий продукт, соответствующий расчетной длине ампликона (таблица). Побочных или неспецифических полос при электрофорезе не наблюдали (рис. 2). Таким образом, аналитическая специфичность теста составила 100%. При исследовании серийных разведений клеток стабильная детекция всех трех генов достигалась при минимальной концентрации 125 тыс. клеток/мл.

Для оценки эффективности амплификации были построены графики линейной регрессии зависимости значения Cp от значения log₂ клеточного эквивалента (CE) (рис. 3).

Анализ линейной регрессии выявил сильную обратную корреляцию между количеством клеток и пороговым циклом (Cp) для всех исследуемых генов. Коэффициенты корреляции Спирмена составили –0,81 для mTOR, –0,84 для RPLP0 и –0,77 для TBP (p < 0,05 во всех случаях), что свидетельствует о статистически значимой зависимости.

Эффективность амплификации, рассчитанная по углу наклона калибровочных кривых, для гена mTOR составила 81%, для RPLP0 — 79%, для TBP — 73%. Полученные значения свидетельствуют о высокой эффективности амплификации, при этом экспериментальные кривые описывались уравнениями: y = 39 – 0,81x для mTOR, y = 33 – 0,79x для RPLP0 и y = 41 – 0,73x для TBP. Близость экспериментальных наклонов к теоретическому значению (b = –1, соответствующему 100% эффективности) подтверждает пригодность подобранных олигонуклеотидов для количественного анализа.

Оценка стабильности референсных генов, проведенная на 27 мультиплексных технических повторах, выявила существенные различия в характере нормализации. При использовании гена RPLP0 медиана относительной экспрессии mTOR (FC) составила 0,02 (межквартильный размах: 0,02–0,03), что указывает на более высокий уровень экспрессии RPLP0 по сравнению с mTOR в исследуемых образцах. Напротив, при нормализации на TBP медиана FC mTOR достигла 9,85 (межквартильный размах: 8,57–12,13), отражая существенно более низкую экспрессию TBP относительно mTOR (рис. 4).

Для оценки вариабельности между техническими повторами было рассчитано отклонение значений FC mTOR от среднего для каждого образца. При нормализации на единственный референсный ген медианное отклонение составило –2,3% (межквартильный размах: от –21,5 до 26,4%) для RPLP0 и 7,2% (межквартильный размах: от –14,3 до 19,2%) для TBP. Использование среднего геометрического обоих генов позволило снизить разброс данных: медианное отклонение составило 4,9%, а межквартильный размах сузился до интервала от –9,0 до 23,4% (рис. 5). Таким образом, нормализация на среднее геометрическое RPLP0 и TBP обеспечивает наименьшую вариабельность результатов и, следовательно, наиболее высокую воспроизводимость количественной оценки экспрессии гена mTOR.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящем исследовании нами была успешно разработана и валидирована мультиплексная ПЦРтест-система для количественного определения уровня экспрессии гена mTOR с нормализацией на референсные гены TBP и RPLP0. На этапе in silico анализа были проведены тщательный отбор и проверка праймеров и зондов по критериям специфичности, термодинамических параметров и отсутствия стабильных димеров. Критически важным достижением стало устранение недостатка ранее опубликованной системы [15] — перекрывания последовательностей зонда и праймера для гена TBP, которое ставило под сомнение надежность получаемых с ее помощью результатов. Предлагаемая нами тестсистема полностью решает эту проблему.

Доклиническая валидация подтвердила высокую аналитическую специфичность (100%) с детекцией единственного специфичного продукта для каждой мишени. Достигнутая аналитическая чувствительность (125 тыс. клеток/мл) является достаточной для работы с большинством типов клинических образцов, включая биоптаты опухолей, и сопоставима с чувствительностью коммерческих наборов для количественной ПЦР.

Эффективность амплификации для всех трех генов находилась в диапазоне от 73 до 81%. Этот диапазон объясняется двумя ключевыми методологическими решениями, принятыми для обеспечения клинической применимости тест-системы. Во-первых, валидацию протокола проводили с использованием широко распространенного набора для выделения РНК («Проба-НК»), чтобы максимально приблизить условия эксперимента к реальной диагностической практике; получаемая при этом чистота РНК, будучи репрезентативной для рутинных условий, может влиять на эффективность амплификации [23]. Во-вторых, для исключения риска амплификации контаминирующей геномной ДНК, остатки которой не полностью удаляются даже современными методами выделения, мы исключили стадию элонгации из протокола ПЦР [19]. Эта мера предосторожности особенно актуальна с учетом высокой процессивности современных Taq-полимераз [24]. Несмотря на эти необходимые компромиссы, специфичность тест-системы сохранилась на уровне 100%, а достигнутая эффективность является приемлемой для относительного количественного анализа [22]. Дальнейшая оптимизация, например, тонкая настройка концентраций праймеров, может позволить еще больше повысить эффективность.

Несмотря на удовлетворительные медианные значения, межквартильные размахи остаются относительно широкими. Это объясняется использованием метрики Fold Change, основанной на экспоненциальной формуле (2(^-ΔΔCp)), которая усиливает влияние даже небольших изменений исходных уровней экспрессии на величину процентной вариабельности. Данный эффект является ожидаемым для относительного количественного ПЦР-анализа и подтверждается тем, что исходные различия значений Cp варьировали в пределах одного цикла. Полученные диапазоны аналитической вариации FC полностью соответствуют данным большинства опубликованных исследований по разработке наборов для относительной количественной ПЦР без использования абсолютных стандартов и согласуются с результатами фундаментальных работ [22, 25]. Так, имеются сообщения о значениях технической вариации FC от 23 до 52% в зависимости от количества технических повторов [26].

Ключевым преимуществом данной работы является проведение строгой аналитической валидации на стандартизированной клеточной линии. Использование клеток SCP-1 обеспечило гомогенную и контролируемую систему, свободную от преаналитических переменных, присущих клиническим образцам (таких как гетерогенность ткани или вариабельное качество РНК). Это позволило точно определить внутренние аналитические параметры ПЦР-теста — специфичность, чувствительность и воспроизводимость — без влияния мешающих биологических факторов. Продемонстрированная надежность разработанной ПЦР-тест-системы является обязательным условием для ее успешного применения при анализе более сложных типов биоматериала, таких как ткани опухолей человека, что станет следующим этапом исследования.

Разработанный мультиплексный ОТ-ПЦР-тест представляет собой прямой и воспроизводимый инструмент для оценки экспрессии mTOR, отражающий интегративную активность сигнального пути PI3K/AKT/mTOR [27], и является многообещающей объективной альтернативой зависимым от оператора методам, таким как иммуногистохимический [28]. В отличие от выявления мутаций в генах (например, BRCA1/2 или PIK3CA), которые, несмотря на свою клиническую полезность, ограничены специфическими подгруппами пациентов и предоставляют информацию о предрасположенности или агрессивности заболевания, наш метод количественно оценивает результирующую активность сигнального пути напрямую. Учитывая роль гиперэкспрессии mTOR при раке молочной железы [1, 6, 28], разработанная тест-система обладает значительным потенциалом для интеграции в будущие диагностические и исследовательские стратегии.

Ограничением данного исследования является использование стандартизированной клеточной линии (SCP-1), которая не отражает всей гетерогенности клинических опухолевых образцов и не учитывает влияние преаналитических переменных [30]. Кроме того, эффективность теста неразрывно связана с конкретными реагентами и протоколами, примененными в данной работе. Следовательно, клиническая применимость разработанной тест-системы для оценки экспрессии mTOR в диагностике и стратификации рака молочной железы должна быть установлена в ходе будущих исследований на репрезентативных тканевых когортах. Такие исследования позволят определить ее диагностическую точность (чувствительность, специфичность, AUC) и оценить возможность внедрения в рутинную клиническую практику. Следует также учитывать, что повышенная экспрессия mTOR наблюдается не только при онкологических, но и при других заболеваниях (например, ревматических патологиях), поэтому интерпретация результатов будет зависеть от типа исследуемого биоматериала и дизайна клинического исследования. В зависимости от поставленной задачи в будущем может потребоваться либо установление диагностических порогов для конкретного типа образцов (например, для биоптатов опухоли), либо введение дополнительных маркеров (например, RILP) для дифференциации схожих по экспрессии mTOR состояний. Несмотря на необходимость дальнейших исследований, разработанная ПЦР-тест-система представляет собой перспективный базовый инструмент для развития молекулярной диагностики рака молочной железы.

ВЫВОДЫ

В настоящем исследовании разработана и валидирована новая мультиплексная ОТ-ПЦР-РВ-тест-система для относительного количественного анализа экспрессии гена mTOR с нормализацией на референсные гены RPLP0 и TBP. Критический недостаток ранее описанного дизайна, заключавшийся в перекрывании последовательностей зонда и праймера для гена TBP, устранен в разработанной тест-системе за счет корректного дизайна олигонуклеотидов, проверки отсутствия межпраймерных взаимодействий и применения оптимальных стратегий предотвращения амплификации геномной ДНК. Тестсистема продемонстрировала 100% аналитическую специфичность и чувствительность на уровне 125 тыс. клеток/мл. Эффективность амплификации составила 73% для TBP, 79% для RPLP0 и 81% для mTOR, что является приемлемым показателем для относительного количественного анализа. В клеточной линии SCP-1 уровень экспрессии mTOR был существенно выше, чем TBP, но ниже, чем RPLP0. Нормализация на геометрическое среднее значений Cp обоих референсных генов обеспечила наилучшую воспроизводимость: медиана отклонения значений Fold Change между техническими повторами составила 4,9%. Разработанная тестсистема позволяет преодолеть критический недостаток дизайна ранее опубликованного аналога и, с учетом роли гиперэкспрессии mTOR в канцерогенезе, может быть перспективным инструментом для развития молекулярной диагностики рака молочной железы.