2026 / 02

DOI: 10.24075/vrgmu.2026.011
Авторские права: © 2026 принадлежат авторам. Лицензиат: РНИМУ им. Н.И. Пирогова.
Статья размещена в открытом доступе и распространяется на условиях лицензии Creative Commons Attribution (CC BY).

ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Надежная и воспроизводимая мультиплексная ОТ-ПЦР-РВ тест-система для количественной оценки экспрессии гена mTOR

Д. О. Корнилов1 , В. М. Симарзина1 , А. А. Бехтер1 , Г. П. Маслаков2 , Д. М. Нечаева1 , А. Е. Карякина1 , Ф. А. Фадеев1,3 , Е. С. Ворошилина1,4 , Д. Л. Зорников1
Информация об авторах

1 Уральский государственный медицинский университет, Екатеринбург, Россия

2 Институт цитологии Российской академии наук, Санкт-Петербург, Россия

3 Центр специализированных видов медицинской помощи «Институт медицинских клеточных технологий, Екатеринбург, Россия

4 Медицинский центр «Гармония», Екатеринбург, Россия

Для корреспонденции: Даниил Олегович Корнилов
ул. Ключевская, д. 17, г. Екатеринбург, 620109; moc.liamg@linrokvolinad

Информация о статье

Благодарности: авторы выражают благодарность сотрудникам лаборатории энтеральных вирусных инфекций ФБУН ФНИИВИ «Виром» Роспотребнадзора за помощь в организации работы.

Вклад авторов: Д. О. Корнилов — разработка концепции, методология, написание рукописи; В. М. Симарзина — проведение экспериментов, методология, визуализация; А. А. Бехтер — проведение экспериментов, визуализация; Г. П. Маслаков — проведение экспериментов, программное обеспечение, валидация; Д. М. Нечаева, А. Е. Карякина — методология, рецензирование и редактирование рукописи; Ф. А. Фадеев — ресурсы, рецензирование и редактирование рукописи; Е. С. Ворошилина — научное руководство, администрирование проекта; Д. Л. Зорников — научное руководство, визуализация, формальный анализ, рецензирование и редактирование рукописи.

Соблюдение этических стандартов: исследование одобрено этическим комитетом ФГБОУ ВО «Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Екатеринбург (протокол № 6 от 18 октября 2024 г.). В работе использовали коммерческие клеточные линии.

Статья получена: 11.03.2026 Статья принята к печати: 25.03.2026 Опубликовано online: 25.03.2026
|
Рис. 1. Дизайн эксперимента для валидации мультиплексной ОТ-ПЦР-РВтест-системы. Схема иллюстрирует две независимые серии разведений, использованные для оценки характеристик теста. Преаналитическая серия (желтый цвет) включала выделение тотальной РНК из клеток SCP-1 при пяти различных исходных концентрациях. Аналитическая серия (синий цвет) была создана путем двукратного серийного разведения РНК, выделенной из самой высокой концентрации клеток. Каждый полученный образец РНК (n = 9) анализировали в трех повторах, что в сумме составило 27 индивидуальных реакций для оценки эффективности ПЦР, аналитической чувствительности и технической воспроизводимости
Рис. 2. Результаты анализа специфичности продуктов амплификации методом электрофореза в агарозном геле. A. Моноплексные реакции: отдельные технические повторы ОТ-ПЦР-РВ для каждого гена. Б. Мультиплексные реакции: технические повторы с одновременной амплификацией всех трех мишеней. Для каждого гена детектируется единственная полоса, соответствующая ожидаемому размеру ампликона, что свидетельствует о высокой специфичности разработанной тест-системы
Рис. 3. Эффективность амплификации целевого гена mTOR и референсных генов RPLP0 и TBP. Анализ эффективности амплификации для генов mTOR, RPLP0 и TBP: графики линейной регрессии значений Crossing Point (Cp) в зависимости от log2 клеточного эквивалента. Экспериментальная эффективность амплификации составила 81% для mTOR (уравнение регрессии: y = 39 – 0,81x), 79% для RPLP0 (y = 33 – 0,79x) и 73% для TBP (y = 41 – 0,73x). Пунктирная красная линия представляет теоретическую 100%-ю эффективность амплификации (наклон = –1), когда значение Cp уменьшается на единицу при каждом двукратном увеличении концентрации клеток; сплошные черные линии показывают фактические линии регрессии; черные точки — отдельные точки данных из мультиплексных технических повторов ОТ-ПЦР-РВ
Рис. 4. Экспрессия mTOR в клетках SCP-1. Экспрессия mTOR стабильно ниже RPLP0, но выше TBP
Рис. 5. Оценка аналитической воспроизводимости при различных стратегиях нормализации. Процентное отклонение значений FC mTOR для каждого образца от общей медианы. Показана воспроизводимость результатов при нормализации экспрессии mTOR на RPLP0, на TBP и на их среднее геометрическое (RPLP0 и TBP). Снижение вариабельности (более узкий интерквартильный размах) достигается при использовании двух референсных генов одновременно
Таблица. Характеристики олигонуклеотидов для мультиплексной ОТ-ПЦР-РВ-тест-системы
Примечание: mTOR — мишень рапамицина млекопитающих, RPLP0 — рибосомный белок P0, TBP — TATA-связывающий белок. Все олигонуклеотиды разработаны в соответствии со стандартными критериями для мультиплексной ПЦР в реальном времени: длина ампликона <150 п.н., согласованные температуры плавления в пределах каждого набора, оптимальный GC-состав, использование различных неперекрывающихся каналов детекции.