Болезнь Вильсона–Коновалова (БВК, OMIM #277900) — аутосомно-рецессивное нарушение метаболизма меди, обусловленное патогенными и вероятно-патогенными вариантами в гене ATP7B, кодирующем медьтранспортирующую АТФазу гепатоцитов [1]. Заболевание характеризуется чрезмерным накоплением меди в печени, головном мозге, роговице и других органах, что приводит к широкому спектру клинических проявлений: от острой печеночной недостаточности и цирроза до неврологических и психиатрических симптомов. Несмотря на моногенный характер, фенотипическая гетерогенность БВК исключительно велика: возраст манифестации варьирует от 2 до 72 лет, а клиническая картина может включать как изолированное поражение печени, так и неврологические симптомы без печеночной недостаточности, их сочетание, а также разнообразные внепеченочные проявления [1].

Одной из ключевых причин такой вариабельности является генотип-фенотипическая корреляция. На сегодняшний день описано более 1000 вариантов в ATP7B, ассоциируемых с БВК; ряд исследований демонстрирует связь определенных вариантов с более ранним началом и тяжелым течением заболевания или с поздней манифестацией и преимущественно печеночной формой [2, 3].

В различных популяциях генотип-фенотипические различия проявляются с учетом наиболее частого/ мажорного варианта. Так, в Европе наиболее частым вариантом является p.His1069Gln (H1069Q), который в гомозиготном состоянии связан с поздним началом заболевания (средний возраст около 20 лет) и преобладанием неврологических симптомов [3, 4]. В восточноазиатских популяциях доминирует патогенный вариант p.Arg778Leu (R778L), который ассоциирован с более ранним началом (часто в детском возрасте) и преимущественно печеночной формой [2, 5].

В некоторых регионах встречаются уникальные/ специфические частые нуклеотидные последовательности (например, c.-436_-422del в Индии и p.Val1146Met на Сардинии), также демонстрирующие характерные клинические особенности [6].

Метаанализы подтверждают, что нонсенс- и frameshift-варианты, приводящие к полному отсутствию функционального белка, коррелируют с более тяжелым и ранним течением, тогда как миссенс-варианты, сохраняющие остаточную активность ATP7B, чаще ассоциированы с более мягким фенотипом и поздним дебютом [2, 7].

Таким образом, понимание генотип-фенотипических корреляций при болезни Вильсона–Коновалова имеет не только теоретическое, но и практическое значение: позволяет прогнозировать течение заболевания, определять приоритет скрининга в конкретных этнических группах и, возможно, в будущем разрабатывать персонализированные подходы к терапии.

Цель работы — выявить закономерности между генетическими вариантами в гене ATP7B и клиническими проявлениями болезни Вильсона–Коновалова на основе секвенирования нового поколения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование выполнено на основе анализа данных 81 пациента с диагнозом «болезнь Вильсона–Коновалова», верифицированным методом NGS (next generation sequencing). Информация получена из клинико-генетической базы данных, содержащей сведения о 296 пациентах с БВК. Наблюдение за пациентами осуществлялось в Клиническом центре (Клиника ревматологии, нефрологии и профпатологии имени Е. М. Тареева) ФГАОУ ВО Первый МГМУ имени И. М. Сеченова (Сеченовский Университет) с 2015 по 2019 гг.

Диагноз БВК устанавливали в соответствии с российскими и европейскими клиническими рекомендациями, применением Лейпцигской балльной шкалы (Лейпциг, 2001). Основные критерии постановки диагноза: результаты молекулярногенетического исследования гена ATP7B; характерные клинические проявления (печеночные и неврологические симптомы, кольцо Кайзера–Флейшера); показатели обмена меди.

Лабораторная диагностика включала: клинический анализ крови и мочи; биохимический анализ крови (с оценкой уровня активности трансаминаз печени, липидного профиля, показателей обмена железа); исследование показателей обмена меди (церулоплазмин в плазме крови, медь в суточной моче). Инструментальные методы включали: УЗИ брюшной полости; офтальмологическое обследование с использованием щелевой лампы.

Молекулярно-генетическое исследование образцов биоматериала (кровь) методом NGS проводили на базе ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д. О. Отта». Применяли таргетную NGS-панель, включающую ген ATP7B и ряд потенциальных генетических модификаторов: HFE, COMMD1, XIAP, CFTR, APOE, PRNP.

Панель реализована на платформе NimbleGen SeqCap EZ Choice (151012_HG38_CysFib_EZ_HX3, ROCHE, Швейцария). Секвенирование выполняли с использованием системы MiSeq Sequencing System (Illumina, США), обеспечивающей высокопроизводительное полногеномное секвенирование.

Подтверждение выявленных вариантов проводили с применением секвенирования по Сэнгеру.

Биоинформатический анализ

Биоинформационный анализ результатов секвенирования образцов ДНК проводили c помощью следующих программ: «GeneTalk» (https://www.gene-talk.de/), «UGENE» (http://ugene.unipro.ru/), «IonReporter» (https://ionreporter.lifetechnologies.com/ir/), «PolyPhen-2» (genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) и «PAPI» ((http://papi.unipv.it/).

Полученные данные интерпретировали в соответствии с рекомендациями Руководства по интерпретации данных [8, 9].

Для прогнозирования эффекта вариантов использовали программы предсказания патогенности: SIFT (http://sift.jcvi.org/), PolyPhen-2 (genetics.bwh.harvard.edu/pph2/), ClinVar, PROVEAN, fathmm-MKL, WilsonGen и другие.

Статистический анализ

В ходе исследования использовали стандартные методики статистического анализа. Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета прикладных статистических программ «IBM SPSS Statistics» (США), а также программы Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Из сформированной клинико-генетической базы данных пациентов с БВК [10] были выбраны материалы пациентов с NGS-исследованием гена ATP7B. Общее количество пациентов 81 (из них 23 мужчины и 58 женщин), средний возраст пациентов на момент обследования составил 29,21 ± 6,5 (от 8 до 68 лет).

Клиническая характеристика

У подавляющего большинства (60%) больных преобладали признаки поражения печени. У 65,72% этих больных были только печеночные проявления, а у 34,28 % больных имели место минимальные неврологические проявления.

Сочетание печеночных и церебральных проявлений (неврологических и психиатрических) выявлено у 31%. Бессимптомное течение (выявлено при семейном скрининге; лечение начато до манифестации) — у 9%. Средний возраст пациентов, выявленных при семейном скрининге, — 15,85 (от 7 до 27 лет).

Варианты дебюта БВК были разделены по тяжести течения: тяжелое течение (декомпенсированный цирроз, фульминантный гепатит, печеночная недостаточность) — 25,8%; относительно нетяжелое течение (хронический гепатит, цирроз без недостаточности, внепеченочные проявления) — 38,5%; внепеченочная патология — 35,7% случаев.

Средний возраст манифестации БВК — 18,21 ± 8,55 (от 5 до 45 лет) (рисунок).

При оценке биохимических маркеров также установлено, что средний уровень церулоплазмина у пациентов достигал 0,113 г/л. Распределение значений по группам выглядело следующим образом: у 38,7% пациентов уровень был ниже 0,1 г/л, у половины обследованных (50%) от 0,1 до 0,2 г/л, а у 11,3% показатели оставались в пределах нормы (свыше 0,2 г/л).

Анализ суточной экскреции меди с мочой показал среднее значение 466,75 мкг/сут при значительном разбросе данных (среднеквадратичное отклонение — 635,82). Лишь у небольшого числа пациентов (4,6%) показатель не превышал нормативные 50 мкг/сут.

Анализ сроков постановки диагноза показал значительную задержку в большинстве случаев. Лишь у трети пациентов (33%) болезнь Вильсона–Коновалова была выявлена в первые три месяца после появления симптомов. У 29% больных диагностика заняла от трех месяцев до года, у 30% — от года до десяти лет, а у 8% пациентов диагноз был установлен лишь спустя более десяти лет после начала заболевания.

В ходе терапии 48,8% пациентов получали комбинированное лечение Д-ПАМ и сульфатом цинка. Монотерапию Д-ПАМ проходили 40,2%, а 8,5% принимали исключительно сульфат цинка. Средняя продолжительность медь-элиминирующей терапии до достижения клинической стабилизации составила 10,25 ± 4,7 месяцев, при этом индивидуальный диапазон варьировался от 2 до 36 месяцев.

Динамику развития БВК оценивали не ранее чем через два года после диагностики и старта лечения (табл. 1). В клинике имени Е. М. Тареева пациенты наблюдались в среднем 5,8 лет; при этом самый длительный период наблюдения составил 46 лет.

Спектр и частота патогенных и вероятно-патогенных вариантов в гене ATP7B

В исследовании проведено секвенирование гена ATP7B у 81 пациента с подтвержденной БВК. Основная группа пациентов относится к русским. Всего выявлен 31 патогенный вариант, их перечень, характеристика и частота встречаемости представлены в табл. 2.

NGS позволил выявить нуклеотидные последовательности на обеих хромосомах у 96% и на 98% аллелей. У 4% пациентов (2% аллелей) кандидатных вариантов не было обнаружено, несмотря на развернутую клиническую картину БВК.

Среди выявленных нуклеотидных последовательностей доминировали три варианта: c.3207C>A (p.His1069Gln) — самый распространенный, выявлен на 51,85% аллелей; c.3190G>A (p.Glu1064Lys) — обнаружен на 8,64% аллелей; c.3402delC (p.Ala1135fs) — отмечен на 6,17% аллелей. Большинство пациентов (72,5%) оказались компаундгетерозиготными, в 16,15% случаев выявлены единичные редкие варианты гена ATP7B. Выявлены ранее не описанные варианты, потенциально связанные с развитием БВК: c.18708A>G; c.3655A>T (p.Ile1219Phe); c.3036dupC (p.Lys1013fs).

По своему эффекту варианты распределились следующим образом: 73,33% — миссенс, 14% аллелей — фреймшифт, 4,67% — варианты сайтов сплайсинга, 4% — нонсенс, 4% —  индел. Варианты обнаружены во всех экзонах гена ATP7B, кроме 1, 3, 5, 9, 10, 12 и 21.

Оценка взаимосвязи между нуклеотидными вариантами и тяжестью течения БВК

В исследовании анализировали связь между эффектом нуклеотидных последовательностей в гене ATP7B и тяжестью течения БВК. В качестве критериев тяжести течения заболевания рассматривали следующие: возраст манифестации (три категории: до 15 лет; 15–31 год; старше 31 года); степень поражения печени на момент дебюта болезни (декомпенсированный цирроз — 33%, компенсированный цирроз — 49,4%, отсутствие цирроза — 17,3%).

Нуклеотидные последовательности группировали в зависимости от их потенциального влияния на белковый продукт (табл. 3).

1. Тяжелые нарушения на обеих копиях гена — нонсенс-варианты, фреймшифт-варианты, варианты сайта сплайсинга.
2. Смешанный эффект — на одной копии гена тяжелые нарушения (нонсенс, фреймшифт, сплайсинг), на второй — относительно мягкие (миссенс-варианты, инделы).
3. Мягкие нарушения на обеих копиях гена — миссенсварианты, инделы.

Возраст манифестации: статистически достоверной связи между генотипом (по эффекту нуклеотидных последовательностей на синтез белка) и возрастом дебюта заболевания не выявлено; случаи поздней манифестации (≥ 31 года) зафиксированы только у пациентов, гомозиготных либо компаунд-гетерозиготных по мажорному варианту.

Поражение печени: отсутствие цирроза чаще отмечалось у гомозиготных и компаунд-гетерозиготных носителей вариантов c.3207C>A (p.His1069Gln) (15% против 2,3%); у пациентов с нонсенс-, фреймшифт- или сплайсинг-вариантами на обеих копиях гена ATP7B при манифестации чаще наблюдался декомпенсированный цирроз печени, а возраст дебюта составлял менее 15 лет.

Таким образом, выявлена корреляция:

между типом манифестации БВК и генотипом (по эффекту нуклеотидной последовательности на синтез белка) выявлена умеренная связь: коэффициент корреляции r = –0,305 (p = 0,009);

между степенью цирроза печени по Чайлд–Пью и потенциальным эффектом нуклеотидных вариантов — умеренная связь r = –0,374 (p = 0,004);

между уровнем холинэстеразы (ХЭ) в крови и эффектом нуклеотидных последовательностей — умеренная связь r = 0,5368 (p = 0,004).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В работе представлены данные пациентов с диагнозом «болезнь Вильсона–Коновалова», верифицированным методом NGS, и результатами анализа связи между тяжестью течения заболевания и типами вариантов в гене ATP7B.

Анализ показал, что полученные данные согласуются с актуальными представлениями о клинических проявлениях и генетическом разнообразии БВК. В частности, подтверждено, что варианты с полной утратой функции белка коррелируют с более тяжелой формой заболевания. Вместе с тем обнаружены некоторые специфические черты, отличающие исследуемую когорту.

Подтверждаются клинический полиморфизм заболевания и преобладание абдоминальной формы [12–14]. Возраст манифестации и сроки диагностики соответствуют мировым тенденциям [12, 15]. Однако отмечены и некоторые отличия. Так, доля бессимптомных случаев (30,6%) в нашей выборке выше, чем в большинстве опубликованных исследований (10–20%) [16].

На сегодняшний день метод NGS активно используют для изучения генетических особенностей БВК по всему миру. В нашем исследовании наиболее частым оказался вариант c.3207C>A (p.His1069Gln) (51,85% аллелей), что соответствует данным по России и Восточной Европе [17, 18]. Второй по частоте стал вариант c.3190G>A (p.Glu1064Lys) (8,63% аллелей), третья по частоте — c.3402delC (p.Ala1135fs) (6,17% аллелей). На 16,15% аллелей выявлены редкие мутации. Три нуклеотидных варианта (c.1870–8A>G, c.3655A>T, c.3036dupC) впервые описаны как патогенные для БВК.

В работе ученых с Дальнего Востока была проанализирована когорта из 100 человек из Восточной Евразии. Мажорная нуклеотидная последовательность p.His1069Gln (c.3207C>A) была выявлена у  48% пациентов (в гомозиготной форме — у  30%); вариант p.Glu1064Lys (c.3190G>A) — у 20%; вариант p.Met769HisfsTer26 (c.2304insC) — 8%, другие варианты составили 23,9% [17].

По данным Human Gene Mutation Database в гене АТР7В распределение типов нуклеотидных последовательностей (60% — миссенс- и нонсенс-варианты; 26% — инделы, 9% — варианты сайтов сплайсинга) схоже и в нашем исследовании, но с более высокой долей миссенс- вариантов (73,33%) [19].

Дополнительно мы провели сравнение спектра выявленных в данном исследовании нуклеотидных последовательностей в гене АТР7В с наиболее распространенной в РФ диагностической панелью для болезни Вильсона−Коновалова (табл. 4).  Из 12 вариантов, включенных в рутинную диагностическую панель, в обследованной выборке обнаружены четыре варианта: c.2304insC; c.3207C>A; c.3402delC; c.3649_3654del6. Выявлены три варианта, которые регулярно регистрировались у обследованных нами пациентов, но не входящие в стандартную панель: c.2332C>G (p.Arg778Gly); c.4125−2A>G; c.3190G>A (p.Glu1064Lys).

Молекулярно-генетическое исследование методом секвенирования нового поколения (NGS) продемонстрировало высокую информативность в выявлении патогенных вариантов при БВК. Стандартная диагностическая панель, применяемая в РФ, охватывает лишь часть спектра вариантов, характерных для российской популяции пациентов с БВК. Метод NGS позволяет выявлять как распространенные, так и редкие варианты, не включенные в стандартные панели. Полученные данные обосновывают необходимость расширения существующих диагностических панелей с учетом региональных особенностей генетического профиля пациентов.

В ходе исследования оценена взаимосвязь между генетическими особенностями (тип варианта, его патогенетический эффект) и клиническими проявлениями БВК, а именно тяжестью течения. Также не выявлено статистически значимой корреляции между гомозиготным носительством мажорного варианта и тяжестью течения заболевания, и иными анализируемыми клиническими показателями, а также возрастом и полом, как и в исследовании Ferenci [14].

Установлена достоверная связь между нуклеотидными последовательностями, существенно нарушающими функцию белкового продукта (нонсенс, фреймшифт, варианты сайта сплайсинга), и следующими клиническими признаками: манифестация БВК с тяжелым поражением печени; более выраженный цирроз печени на момент диагностики; сниженный уровень холинэстеразы (ХЭ).

Полученные результаты согласуются с некоторыми исследованиями. Так, в одной из работ значимая корреляция была выявлена только для нонсенс-мутаций, а для миссенс-мутаций она была слабая или отсутствовала [4]. Была продемонстрирована корреляция между нонсенс- и фреймшифт-вариантами и более ранним дебютом заболевания, а также тяжелым течением БВК [20].

В ряде крупных исследований показана лишь слабая или отсутствующая генотип-фенотипическая корреляция.

Согласно исследованию китайских ученых, генотип объясняет только 38% вариабельности возраста дебюта [7].

По данным EuroWilson registry, генотип объясняет около 27% вариабельности возраста дебюта и менее 20% вариабельности формы заболевания (печеночная либо неврологическая) [21]. При миссенс-вариантах p.His1069Gln и p.Glu1064Lys моторные нарушения выявлялись в 53–58%, изменения на МРТ мозга — 59–69%, кольца КайзераФлейшера — 29–31%, когнитивные нарушения — 24–27%. При LOF варианте p.Met769HisfsTer26 у 60% пациентов отмечались изменения печени на УЗИ. Гендерной зависимости не было выявлено [17].

Несмотря на обнаруженную в нашем исследовании умеренную корреляцию между характером нуклеотидных последовательностей в гене ATP7B и тяжестью течения болезни Вильсона–Коновалова, установление четких генотип-фенотип взаимосвязей остается сложной задачей. Это обусловлено комплексом взаимосвязанных факторов, которые можно систематизировать по нескольким ключевым направлениям.

Генетические факторы

Вариабельная экспрессивность и клинический полиморфизм. Так, в пределах одной семьи при идентичном генотипе наблюдается широкий спектр клинических проявлений — от бессимптомного течения до тяжелых полиорганных поражений [14, 22]. Это указывает на влияние дополнительных генетических и средовых модификаторов.

Высокая генетическая гетерогенность. Более чем у 60% пациентов выявлена компаунд-гетерозиготность по двум различным патогенным вариантам. При этом функциональные последствия большинства редких нуклеотидных последовательностей остаются неизученными, что затрудняет прогнозирование фенотипа [23].

Отсутствие единообразия фенотипа у гомозигот по мажорному варианту. Пациенты с идентичным генотипом (например, гомозиготы по p.H1069Q) демонстрируют существенные различия в возрасте дебюта, тяжести поражения печени и неврологической симптоматике [4, 7].

Влияние генетических модификаторов. Помимо основного гена ATP7B, на фенотип влияют варианты в других генах: MTHFR (метаболизм гомоцистеина); COMD1, ATOX1, XIAP (гомеостаз меди); APOE (липидный обмен); PRNP, HFE (общие метаболические пути) и др. Эти полиморфные варианты оказывают заметное влияние на возраст дебюта (до 5–12 лет) [24, 25].

Клинико-демографические факторы

Половые различия. У женщин дебют БВК в среднем наступает на 3–6 лет позже, чем у мужчин, что связывают с протективным действием эстрогенов на метаболизм меди. Гормональный фон, пубертатный период и менопауза могут провоцировать обострение симптомов или изменять их выраженность [26].

Средовые и эпигенетические факторы

Диетические особенности, повышенное потребление меди (например, с питьевой водой или продуктами) способны ускорять манифестацию заболевания.

Коморбидные состояния. Инфицирование вирусным гепатитом, злоупотребление алкоголем или прием гепатотоксичных препаратов усугубляют поражение печени.

Эпигенетическая регуляция. Метилирование ДНК, модификации гистонов и действие некодирующих РНК могут модулировать экспрессию ATP7B и геновмодификаторов, влияя на фенотип [27].

Методологические ограничения исследований

Неоднородность критериев фенотипирования. Разные исследования используют различные шкалы для оценки тяжести поражения печени, неврологических симптомов и биохимических маркеров. Недостаточный охват семейного скрининга. Отсутствие данных о родственниках затрудняет анализ сегрегации генотипа и фенотипа в семьях.

Поздняя диагностика. Многие пациенты обращаются за помощью уже на стадии декомпенсации цирроза или неврологических осложнений, что искажает представления о естественной истории болезни.

Селективная потеря данных. Пациенты с тяжелыми генотипами чаще подвергаются трансплантации печени или погибают до включения в исследование, создавая «смещение выживаемости».

Ограниченная выборка. Малые размеры когорт снижают статистическую мощность для выявления корреляций, особенно для редких мутаций [13, 28].

Многофакторность патогенеза БВК объясняет трудности в установлении однозначных генотип-фенотип связей. Для преодоления этих ограничений необходимы: крупные многоцентровые исследования с унифицированными критериями фенотипирования; комплексный анализ не только ATP7B, но и генетических-модификаторов; учет средовых и эпигенетических факторов в моделях прогнозирования; проспективные наблюдения за семьями с установленным генотипом.

Только такой интегративный подход позволит повысить точность прогнозирования течения БВК и персонализировать терапевтические стратегии.

Несмотря на отсутствие прямой корреляции между генотипом и возрастом манифестации БВК, проведенный анализ выявил зависимость тяжести поражения печени и от характера нуклеотидных вариантов. Применение методов NGS в клинической практике существенно упрощает и ускоряет диагностику БВК, что позволяет оперативно инициировать медь-элиминирующую терапию.

ВЫВОДЫ

В ходе исследования с применением секвенирования нового поколения (NGS) у российской когорты пациентов с болезнью Вильсона–Коновалова (БВК) выявлен 31 патогенный вариант в гене ATP7B, среди которых наиболее распространенными стали c.3207C>A (p.His1069Gln), c.3190G>A (p.Glu1064Lys) и c.3402delC (p.Ala1135fs). Установлена связь между нуклеотидными последовательностями, вызывающими тяжелые нарушения белка ATP7B (нонсенс-варианты, фреймшифт-варианты и варианты сайтов сплайсинга), и неблагоприятными клиническими проявлениями БВК (тяжелое поражение печени, выраженный цирроз, сниженный уровень холинэстеразы), тогда как гомозиготность по варианту c.3207C>A (p.His1069Gln) не коррелировала с тяжестью течения. Полученные данные подтверждают высокую диагностическую эффективность NGS при БВК и подчеркивают перспективность дальнейших исследований генотип-фенотипических взаимодействий для персонализации терапии и улучшения клинического ведения пациентов.