К «классическим» бордетеллам относят Bordetella bronchiseptica, Bordetella parapertussis и Bordetella pertussis. B. pertussis является строгим патогеном человека и возбудителем коклюша — респираторного заболевания, которое у младенцев и пожилых людей может протекать особенно тяжело, вплоть до летального исхода [1–3]. B. parapertussis представлена двумя специализированными линиями: человеческой, вызывающей коклюш, и овечьей, ассоциированной с респираторной инфекцией овец [4]. B. bronchiseptica имеет более широкий круг хозяев, вызывая острые и хронические респираторные инфекции у различных млекопитающих [3, 5]. Инфекции человека встречаются значительно реже, однако их клинические проявления варьируют от бессимптомного носительства до бронхита, пневмонии и сепсиса [5].

«Классические» бордетеллы обладают схожим набором основных факторов вирулентности, включающим поверхностные адгезины, фимбрии, токсины и системы секреции [3, 4]. Состав и функциональность этих факторов различаются между видами и отдельными филогенетическими линиями. У B. bronchiseptica регион ptx–ptl, кодирующий коклюшный токсин и аппарат его секреции, присутствует не во всех филогенетических линиях и в отдельных геномах может быть утрачен или значительно дивергирован [4]. В штаммах, сохраняющих этот локус, продукция коклюшного токсина может быть нарушена из-за изменений в промоторной области. Однако экспериментально было показано, что внесение четырех нуклеотидных замен в промотор ptx B. bronchiseptica оказалось достаточным для активации экспрессии коклюшного токсина до уровня B. pertussis [6].

Историческое разграничение «классических» бордетелл на отдельные виды основывалось на совокупности фенотипических, клинических и экологических признаков, включая круг хозяев, характер вызываемого заболевания, культурально-биохимические свойства [7]. Позднее сравнительно-геномные исследования показали, что различия между этими видами были связаны с утратой и инактивацией генов, накоплением инсерционных последовательностей и перестройками генома [8, 9]. Изменения затрагивали, в частности, гены поверхностных структур, метаболических путей и регуляторных систем и могли способствовать адаптации к разным хозяевам [8].

Несмотря на сохранение трех самостоятельных видовых названий, классические бордетеллы характеризуются высоким геномным сходством. Значения средней нуклеотидной идентичности (ANI) между ними составляют 98,3–99,4%, что превышает обычно используемую границу разграничения бактериальных видов — около 95–96% [2]. Поэтому в геномной классификации Bridel et al. отнесли B. bronchiseptica, B. parapertussis и B. pertussis к одной группе, обозначенной как B. bronchiseptica genomic species [2]. Такое обозначение не отменяет традиционных видовых названий, а подчеркивает их близость по современным геномным критериям.

Филогеномные исследования показали также, что B. pertussis и человеческая линия B. parapertussis независимо возникли из разных B. bronchiseptica-подобных линий [8–10]. Их адаптация к ограниченному кругу хозяев сопровождалась редукцией генома, накоплением псевдогенов, распространением инсерционных последовательностей и потерей части метаболических и регуляторных функций [4, 8–10].

В коллекции Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г. Н. Габричевского находился 31 ранее не охарактеризованный изолят B. bronchiseptica, выделенный от разных хозяев: 25 — от человека и 6 — от животных. Анализ этой коллекции в сравнении с референсными геномами классических бордетелл позволил определить положение исследуемых изолятов относительно известных филогенетических линий B. bronchiseptica и оценить, связаны ли выявленные филогенетические различия с вариабельностью функционально значимых геномных признаков. Целью настоящей работы было определить филогенетическое положение и геномные особенности этих изолятов, а также оценить их разнообразие в контексте известных линий классических бордетелл.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе исследовали 31 коллекционный изолят B. bronchiseptica: 25 изолятов, полученных от человека в рамках работы Референс-центра по мониторингу за коклюшем ФБУН МНИИЭМ имени Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора, и 6 изолятов от животных, предоставленных ФГБОУ ВО МГАВМиБ — МВА имени К. И. Скрябина (три от свиней, два от кроликов и один от домашнего кота).

В сравнительный анализ дополнительно включили 30 референсных геномов из NCBI: по 10 геномов B. bronchiseptica, B. pertussis и B. parapertussis (человеческая линия). Отбор штаммов проводили по базе BacDive (DSMZ), при этом для каждого вида включали типовой штамм. Геномные сборки выбранных штаммов загружали из NCBI по идентификаторам, которые указаны в BacDive. Перечень использованных референсных штаммов и их идентификаторы приведены в приложении (табл. S2).

Культивирование изолятов

Культивирование изолятов проводили в соответствии с МУК 4.2.3701-21 «Лабораторная диагностика коклюша и заболеваний, обусловленных другими бордетеллами». Лиофилизированные культуры хранили при 2–8 °C. Перед исследованием культуры регидратировали 0,5 мл стерильного 0,9%-го раствора NaCl, высевали по 0,1 мл на Бордетелагар (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск) с 10% дефибринированной бараньей крови и инкубировали при 37 °C в течение 24 ч.

Морфологическая и биохимическая идентификация

Морфологию колоний оценивали с помощью стереоскопического микроскопа SteREO Discovery V12 (Carl Zeiss, Германия). Тинкториальные свойства определяли окраской по Граму с последующей световой микроскопией. Биохимическая идентификация включала определение каталазной, оксидазной, тирозиназной и уреазной активности, способности редуцировать нитраты и ассимилировать цитрат. Подвижность определяли по характеру роста в полужидком питательном агаре. Исследования выполняли в соответствии с МУК 4.2.3701-21.

Полногеномное секвенирование, сборка и аннотация геномов

Геномную ДНК выделяли с помощью набора ExtractDNA Blood & Cells («Евроген», Россия) по инструкции производителя. Целостность ДНК оценивали электрофорезом в 1,5%-м агарозном геле, концентрацию — с помощью набора Spectra Q HS Plus (Raissol, Россия) на флуориметре Qubit 2 (Invitrogen, США).

Библиотеки готовили из 220 нг ДНК с помощью набора MGIEasy Fast PCR-Free FS DNA Library Prep Set V2.0 (MGI, Китай), объединяли в эквимолярном соотношении и циркуляризовали с помощью MGIEasy Dual Barcode Circularization Kit (MGI, Китай). Секвенирование проводили на платформе DNBSEQ-G50 (MGI, Китай) в парноконцевом режиме 2 × 150 нт с использованием проточной ячейки FCL PE150.

Контроль качества и фильтрацию прочтений проводили в fastp v0.24.1 [11], сборку de novo — в Unicycler v0.5.1 [12], оценку качества геномных сборок — в QUAST v.5.2.0 [13] с настройками по умолчанию. Полноту и контаминацию сборок оценивали с помощью CheckM2 v1.1.0 [14]. Для пангеномного и метаболического анализа отбирали сборки с наилучшими показателями полноты и контаминации; все включенные сборки имели полноту > 95% и контаминацию < 5%. Показатели качества сборок, включая число контигов, N50, полноту и контаминацию, представлены в приложении (табл. S1). Аннотацию геномов выполняли в Bakta v1.12 с настройками по умолчанию [15].

ANI и филогенетический анализ

Для оценки генетического сходства рассчитывали ANI с помощью OrthoANI v.1.40 [16]. Филогенетический анализ по 120 маркерным генам BAC120 проводили в GTDBTk v.2.6.1 [17] для общей филогеномной реконструкции. После выравнивания 120 маркерных белков применяли стандартную каноническую маску GTDB-Tk; длина конкатенированного аминокислотного выравнивания была сокращена с 41 084 до 5036 позиций. Полученное дерево укореняли по Achromobacter xylosoxidans DSM2402 (GCA_000508285.1), выбранному в качестве близкородственной внешней группы по результатам BLAST-поиска гомолога гена rpoB Bordetella bronchiseptica, с исключением представителей рода Bordetella [18]; обоснованность такого выбора также подтверждается опубликованными филогенетическими данными [19, 20].

Для оценки устойчивости положения основных филогенетических групп к выбору маркерного набора дополнительно выполняли реконструкцию по 42 рибосомным белкам. С помощью UBCG2 v.2.0 [21] для филогенетического анализа идентифицировали 81 консервативный ген. Из данного набора для последующего анализа были отобраны 42 гена, кодирующие рибосомные белки, относящиеся к группам rpl, rpm, rps. Далее выравнивали их аминокислотные последовательности в MAFFT v.7.48 (L-INS-i) [22] и конкатенировали в AMAS v.1.0 [23]. Дерево максимального правдоподобия строили в IQ-TREE v.2.4.0 [24] с автоматическим выбором модели и 1000 бутстреп-репликами и визуализировали в iTOL [25].

Поиск генов антибиотикорезистентности и факторов вирулентности

Гены антибиотикорезистентности и факторов вирулентности выявляли с помощью ABRicate v.1.0.1 [26] по базам CARD и VFDB. Матрицы числа выявленных хитов формировали в R с использованием tidyverse и визуализировали с помощью ComplexHeatmap. В анализ включили совпадения с нуклеотидной идентичностью ≥ 60% и покрытием референсной последовательности ≥ 80%.

Поиск систем антифаговой защиты

Системы антифаговой защиты идентифицировали в 61 геноме Bordetella с помощью PADLOC v.1.1.0 с параметрами по умолчанию [27].

Поиск профаговых областей

Профаговые области в 61 геноме Bordetella выявляли с помощью PHASTEST [28] и Phigaro v.1.1.0 [29] с параметрами по умолчанию. PHASTEST классифицировал профаги как интактные (score > 90), сомнительные (70–90) или неполные (< 70), а Phigaro использовали для уточнения их координат и характеристик.

Анализ пангенома и метаболизма

Пангеномный и метаболический анализ проводили для 20 геномов: 13 лабораторных изолятов B. bronchiseptica, отобранных по качеству сборок, и референсных геномов из NCBI, представлявших B. bronchiseptica, B. pertussis, B. parapertussis и A. xylosoxidans DSM2402. Анализ выполняли в Anvi’o v9 [30]. Пангеном строили с помощью anvi-pan-genome (--minbit 0,5, --min-percent-identity 30, --mcl-inflation 2, NCBI BLAST), функциональную аннотацию проводили по COG24 и KEGG/KOfam, полноту метаболических модулей оценивали с помощью anviestimate-metabolism.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Фенотипические признаки

На Бордетелагаре колонии B. bronchiseptica были круглые, выпуклые, влажные, гладкие, блестящие сероватокремового цвета с ровными краями, имели мягкую маслянистую консистенцию и легко снимались петлей (рис. 1А). При окрашивании по Граму B. bronchiseptica представляли собой грамотрицательные короткие палочки, в мазках располагались одиночно, парами или группами (рис. 1Б). По биохимическим тестам B. bronchiseptica продуцировали фермент уреазу, обладали каталазной и оксидазной активностью, не продуцировали фермент тирозиназу, росли на цитратном агаре Симмонса и редуцировали нитраты в нитриты. Кроме того, B. bronchiseptica росли на 10%-м кровяном агаре и МПА и показали подвижность, что проявлялось диффузным ростом в полужидком агаре по ходу укола и вокруг него.

Анализ средней идентичности нуклеотидов (ANI)

Сравнительный анализ ANI для 61 генома рода Bordetella (31 исследуемый геном B. bronchiseptica и 30 референсных геномов) выявил несколько групп с высоким уровнем сходства (рис. 2). Внутри выделенных групп значения ANI составляли 99,2–100%, между геномами, отнесенными к разным группам, — 97,2–99,9%. Все полученные значения превышали обычно используемый порог разграничения бактериальных видов, равный 95–96%, что подтверждало высокое геномное сходство классических бордетелл. Перекрытие диапазонов отражает отсутствие единого порогового значения ANI, разделяющего выделенные группы; их разграничение основывалось на структуре дендрограммы попарных значений ANI, а не на фиксированном пороге.

Анализ GTDB-Tk

Филогенетический анализ по набору из 120 маркерных белков, выполненный для 61 генома Bordetella и генома A. xylosoxidans DSM2402, использованного в качестве внешней группы, показал, что геномы B. pertussis и человеческой линии B. parapertussis образовали отдельные компактные клады, тогда как геномы B. bronchiseptica не сформировали единой монофилетической группы (рис. 3).

Анализ рибосомных белков

Филогенетический анализ на основе объединенных выравниваний аминокислотных последовательностей 42 рибосомных белков, выполненный для тех же 61 генома Bordetella и генома A. xylosoxidans DSM2402, показал также, что геномы B. bronchiseptica не формировали единой компактной монофилетической группы (рис. 4). Исследованные изоляты распределились по нескольким филогенетическим группам, часть которых располагалась на древе ближе к кладам B. pertussis и B. parapertussis. Клады B. pertussis и B. parapertussis имели бутстрепподдержку 99–100%. Отдельные группы B. bronchiseptica также характеризовались высокой поддержкой, тогда как для ряда внутренних ветвей значения бутстреп-поддержки были ниже 50%.

Гены антибиотикорезистентности и факторы вирулентности

Наибольшее число детерминант резистентности выявили у изолятов 882, 883, 884 и 937-1. Изоляты 882 и 883 имели одинаковый профиль из шести генов: BOR-1, APH(3')-Ia, aadA, qacEΔ1, sul1 и tet(A). У изолята 884 обнаружили фрагментированные последовательности APH(3')-Ia и sul1, а также aadA и qacEΔ1. У изолята 937-1 выявили BOR-1, TEM-112, APH(3')-Ia, catA1 и регуляторный ген evgA.

Во всех 10 геномах B. parapertussis из анализируемых детерминант выявляли только BOR-1, тогда как в геномах B. pertussis приобретенные гены антибиотикорезистентности при заданных порогах не обнаруживали. Ген prn, кодирующий пертактин, обнаружили во всех геномах B. pertussis и B. parapertussis, а также в 39 из 41 генома B. bronchiseptica; в сборках изолятов 884 и 885 prn не выявляли.

Локус ptx–ptl, кодирующий субъединицы коклюшного токсина и систему его секреции, обнаруживали во всех 10 геномах B. pertussis и B. parapertussis и в 31 из 41 генома B. bronchiseptica. Его распределение соответствовало филогенетической структуре выборки: ptx–ptl-положительные геномы B. bronchiseptica распределялись по нескольким ветвям, тогда как 10 ptx–ptl-отрицательных геномов (1423, 19-24, 21-23, 25-24, 69-23, 69-24, 7-13, 899t, F709 и FDAARGOS_634) формировали отдельную ветвь.

Помимо локуса ptx–ptl, в исследованных геномах выявляли широкий набор других факторов вирулентности. Гены bvgA и bvgS, кодирующие двухкомпонентную систему регуляции вирулентности, обнаруживали во всех геномах B. pertussis и B. parapertussis и соответственно в 40 и 38 из 41 генома B. bronchiseptica. Компоненты системы секреции III типа (bsc, bopB, bopD, bopN, bsp22, bteA/bopC), участвующей во взаимодействии с клетками хозяина и доставке эффекторных белков, были широко представлены у всех трех видов; большинство соответствующих генов выявляли в 39–41 из 41 генома B. bronchiseptica. Локус аденилатциклазного токсина также был преимущественно сохранен: cyaA выявляли в 38 из 41 генома B. bronchiseptica; обнаруживали также гены локуса, связанные с активацией и секрецией токсина (cyaC и cyaBDE). Ген dnt, кодирующий дермонекротический токсин, выявляли в 32 из 41 генома B. bronchiseptica и во всех исследованных геномах B. pertussis и B. parapertussis. Более выраженная вариабельность отмечалась среди факторов адгезии: prn выявляли в 39 из 41 генома B. bronchiseptica, fim3 — в 39 из 41, а fim2 — в 28 из 41; fim2 присутствовал во всех геномах B. pertussis и не выявлялся ни в одном из исследованных геномов человеческой линии B. parapertussis. Наибольшая вариабельность покрытия отмечалась для fhaB, кодирующего филаментозный гемагглютинин: в исходных результатах ABRicate совпадения с fhaB выявляли в 17 из 41 генома B. bronchiseptica, однако принятому порогу покрытия ≥ 80% соответствовали только восемь геномов.

Профаговые области

Анализ профаговых областей выявил их наличие исключительно в геномах B. bronchiseptica и B. pertussis. У B. parapertussis профаговые области отсутствовали.

Среди 47 обнаруженных профаговых областей 42 были классифицированы как интактные. При анализе выявлено, что профаги в исследованных изолятах относятся преимущественно к фагам, инфицирующим Pseudomonas, Burkholderia, а также Bordetella. Большинство профагов отнесено к сифовирусам. У изолятов B. bronchiseptica 20-24, 69-24, 7-13 и S-55 обнаружено сосуществование профагов, соответствующих фагам трех разных морфологических типов — миовирусов, подовирусов, сифовирусов.

Системы антифаговой защиты

У B. bronchiseptica наблюдали наиболее широкий диапазон числа предсказанных защитных локусов — от 4 до 29 на геном. Среди них выявляли RM-системы типов I и II, AbiE, dXTPase, Lamassu, защитные кассеты PDC (M06, M40, S02, S34) и системы Zorya типов I–III. Все 10 геномов человеческой линии B. parapertussis имели одинаковый набор из 13 защитных локусов, включавший RM-системы типов I и II, AbiE, dXTPase, PDC_S19 и Zorya типов I–III. В геномах B. pertussis выявили по семь защитных локусов; RM-системы не определялись, а среди обнаруженных систем присутствовали dXTPase, PDC_M06 и SoFic.

Пангеномный анализ и анализ метаболизма

В пангеноме, построенном для 20 отобранных геномов, выделили 9348 генных кластеров, из которых 6736 получили функциональную аннотацию, а 2612 остались без установленной функции (рис. 6). В исследованной подвыборке геномы B. bronchiseptica различались по присутствию ряда генных кластеров, тогда как у B. pertussis и B. parapertussis часть кластеров отсутствовала.

Во всех 20 геномах, включенных в метаболический анализ, 58 основных модулей характеризовались полнотой ≥ 75% (рис. 7; полноразмерная версия представлена в приложении на дополнительном рис. S1). Сохранялись гликолиз, глюконеогенез, пентозофосфатный путь, цикл трикарбоновых кислот и глиоксилатный цикл, а также основные пути биосинтеза аминокислот, нуклеотидов, жирных кислот, фосфолипидов, кофакторов и витаминов и основные компоненты дыхательной цепи.

Среди сигнатурных модулей наиболее заметные различия касались модуля «pertussis pathogenicity signature, pertussis toxin», который выявляли у B. pertussis и части исследованных геномов B. bronchiseptica и B. parapertussis.

В кладе, включавшей изоляты B. bronchiseptica 69-23, 69-24, 25-24, 21-23 и 14-23, этот модуль не определялся. В трех включенных в анализ геномах B. pertussis также не выявляли ряд модулей, присутствовавших у B. bronchiseptica и B. parapertussis, в том числе связанных с азотным обменом, деградацией ароматических соединений и биосинтезом нуклеотидных сахаров.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полногеномное сравнение подтвердило близкое филогенетическое родство классических бордетелл. Значения ANI между исследованными и референсными геномами превышали видовой порог, что соответствует представлению о B. bronchiseptica, B. parapertussis и B. pertussis как о близких таксонах в составе B. bronchiseptica genomic species [2]. Анализ тепловой карты ANI и филогенетических древ показал неоднородность внутри этой группы. Филогенетические реконструкции по BAC120маркерам и рибосомным белкам дали схожую картину. B. pertussis и B. parapertussis образовывали компактные клады, тогда как изоляты B. bronchiseptica распределялись между несколькими линиями. Это соответствует опубликованным данным о происхождении B. pertussis и человеческой линии B. parapertussis от разных B. bronchiseptica-подобных предков [8–10]. Поэтому в данной выборке B. bronchiseptica представлена не как единая монофилетическая группа, а как разнородный комплекс близких линий.

Кроме того, бутстреп-поддержка (< 50%) ряда внутренних ветвей B. bronchiseptica указывает на ограниченное разрешение отношений между наиболее близкородственными геномами при использовании набора консервативных рибосомных маркеров. Поэтому точную топологию таких ветвей следует интерпретировать с осторожностью.

Распределение факторов вирулентности тоже было неодинаковым. Локус ptx–ptl выявлялся не у всех изолятов B. bronchiseptica, а ptx–ptl-отрицательные геномы образовывали отдельную филогенетическую ветвь. Таким образом, распределение локуса ptx–ptl

соответствовало филогенетическому положению исследованных геномов B. bronchiseptica. Наличие локуса в геноме само по себе не свидетельствует о продукции функционального коклюшного токсина: для оценки токсигенности необходимы анализ регуляторных участков и экспериментальное подтверждение экспрессии [6].

Вариабельность затрагивала и другие токсинассоциированные факторы. Ген cyaA, кодирующий аденилатциклазный токсин, выявляли у большинства, но не у всех геномов B. bronchiseptica, а dnt, кодирующий дермонекротический токсин, отсутствовал в части исследованных геномов этого вида. В то же время большинство компонентов системы секреции III типа (bsc, bopB, bopD, bopN, bsp22, bteA/bopC) были широко представлены в исследованной выборке. Гены bvgA и bvgS, кодирующие двухкомпонентную систему глобальной регуляции вирулентности, также сохранялись в большинстве геномов.

Различия выявлялись и среди поверхностных факторов, участвующих в адгезии и колонизации. Гены prn, кодирующий пертактин, и fim3, кодирующий одну из основных субъединиц фимбрий, присутствовали в большинстве геномов B. bronchiseptica, тогда как fim2 характеризовался вариабельным распределением и не выявлялся в исследованных геномах человеческой линии B. parapertussis. Наибольшая вариабельность покрытия отмечалась для fhaB. Неполное покрытие этого гена у части изолятов может отражать как реальную межлинейную вариабельность, так и фрагментированность отдельных геномных сборок, поэтому результат требует осторожной интерпретации. Вариабельное распределение fim2 также указывало на различия в наборе адгезивных факторов между отдельными группами классических бордетелл.

В исследованной выборке у B. bronchiseptica выявляли более разнообразный набор потенциальных детерминант антибиотикорезистентности, чем у B. pertussis и B. parapertussis. Наибольшее число таких детерминант выявили у изолятов 882, 883, 884 и 937-1. Эти результаты следует трактовать осторожно: в работе оценивали наличие соответствующих генов, а не фенотипическую чувствительность к препаратам.

Профаговые области и системы антифаговой защиты были также наиболее вариабельны у B. bronchiseptica. Это может отражать более широкую экологическую нишу вида и более частые контакты с разными фагами. У B. pertussis и B. parapertussis такие профили были более однотипными, что согласуется со специализацией этих видов к определенному хозяину и редукцией их генома. Однако функциональность предсказанных профагов и защитных систем требует отдельной экспериментальной проверки.

Пангеномный и метаболический анализы дополнили филогеномные данные. В исследованной подвыборке «классических» бордетелл сохранялось общее геномное ядро и основные пути центрального метаболизма. В то же время у B. pertussis и B. parapertussis отсутствовала часть генных кластеров и метаболических модулей в сравнении с B. bronchiseptica, что соответствует ранее описанной редукции генома при адаптации к более узкому кругу хозяев [8, 9].

Таким образом, исследованные коллекционные изоляты B. bronchiseptica представляют несколько филогенетических вариантов внутри комплекса «классических» бордетелл. Выявленные различия между линиями затрагивают не только их филогенетическое положение, но и состав генов, связанных с вирулентностью, антибиотикорезистентностью, профагами, системами антифаговой защиты и отдельными метаболическими путями. Это позволяет предположить, что данные различия имеют эволюционную природу и могут отражать адаптацию к различным экологическим нишам, в том числе к хозяину.

ВЫВОДЫ

Исследуемые изоляты B. bronchiseptica распределились между несколькими филогенетическими линиями, тогда как B. pertussis и представители человеческой линии B. parapertussis в исследованной выборке формировали компактные клады. Линии B. bronchiseptica различались по составу факторов вирулентности, потенциальных детерминант антибиотикорезистентности, профагов и систем антифаговой защиты; распределение локуса ptx–ptl соответствовало филогенетической структуре изолятов. Несмотря на выраженную филогенетическую и функционально-геномную неоднородность B. bronchiseptica, классические бордетеллы характеризовались высоким геномным сходством и сохранением основных метаболических функций.