Staphylococcus epidermidis является представителем нормальной микрофлоры кожи и слизистых оболочек человека [1, 2]. Однако у новорожденных с очень низкой и экстремально низкой массой тела бактерии этого вида могут вызывать такие опасные заболевания, как пневмония, сепсис и катетер-ассоциированные инфекции. Патогенность разных штаммов S. epidermidis варьируется в широких пределах: от способности вызывать заболевания до комменсального способа существования. Несмотря на определенный прогресс в изучении механизмов патогенности S. epidermidis, они до сих пор изучены не полностью.

Различные штаммы S. epidermidis обладают разными генетическими свойствами. Разработан и широко используется метод мультилокусного секвенирования (Multilocus Sequence Typing, MLST), который позволяет подразделять штаммы бактерий на большое количество сиквенс-типов. Хотя число сиквенс-типов у S. epidermidis довольно велико, обнаружено, что большинство штаммов, циркулирующих в госпиталях различных стран мира, можно объединить в единый клональный комплекс CC2, к которому относятся близкородственные сиквенс-типы [2, 3]. Среди госпитальных штаммов S. epidermidis широко распространена устойчивость к метициллину, ассоциированная с мобильными генетическими элементами, которые получили название хромосомных стафилококковых кассет mec (Staphylococcal cassette chromosome mec, SCCmec) [1, 4]. Устойчивость к метициллину определяется геном mecA, который кодирует альтернативный пенициллин-связывающий белок, обладающий пониженным сродством к метициллину (оксациллину). Метициллин-резистентность крайне важна в клинической практике, поскольку наличие гена mecA обуславливает устойчивость штамма стафилококка ко всем бета-лактамным антибиотикам (пенициллины, включая защищенные, цефалоспорины и карбапенемы). Набор генов, находящихся в элементах SCCmec, может различаться. Среди них встречаются гены устойчивости к другим антибиотикам, инсерционные элементы, такие как IS431, плазмиды, такие как pT181, и транспозоны, например Tn554.

Среди госпитальных штаммов S. epidermidis также часто отмечают устойчивость к аминогликозидам и макролидам и, в меньшей степени, к тетрациклину, хлорамфениколу, ванкомицину и клиндамицину [5]. Устойчивость к метициллину (оксациллину) у госпитальных штаммов, по некоторым данным, превышает 70 % [6, 7]. Гены устойчивости к антимикробным препаратам у S. epidermidis часто находятся в мобильных генетических элементах. В целом отмечается высокий уровень корреляции между наличием генов резистентности и фенотипическим проявлением резистентности у штаммов бактерий [1, 8].

Штаммы S. epidermidis имеют ряд факторов патогенности — генов, кодирующих синтез белков, которые способствуют развитию инфекции и существованию бактерий в организме человека. Несмотря на наличие работ, связывающих уровень патогенности бактерий с какими-либо факторами патогенности, в настоящее время невозможно выделить маркеры патогенности, позволяющие однозначно отделить патогенные штаммы от непатогенных [1]. Возможно, что прогресс в решении этой задачи будет связан с изучением комплексных взаимодействий между бактериями и иммунной системой человека. Многие факторы патогенности входят в состав базовой части генома и имеются у всех или у подавляющего большинства штаммов S. epidermidis. Другие же факторы, ассоциированные с патогенностью, содержатся только у части штаммов. Один из подходов к анализу генетических свойств штаммов микроорганизмов — это применение высокопроизводительного полногеномного секвенирования, которое позволяет проводить комплексный анализ генетических свойств штаммов с детекцией большого количества генов и их вариантов с помощью биоинформатического анализа полученных сборок. В НЦАГиП им. В. И. Кулакова проводят исследования генетического полиморфизма различных видов микроорганизмов, циркулирующих в стационаре [2, 9].

Целью данной работы было изучение генетического полиморфизма госпитальных штаммов S. epidermidis, выделенных от новорожденных отделения реанимации и интенсивной терапии НЦАГиП им. В. И. Кулакова.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ 

У новорожденных отделения реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) НЦАГиП были выделены 14 штаммов S. epidermidis: у 5 новорожденных из образцов трахеобронхеального аспирата (штаммы 3, 7, 8, 13, 14), у 3 — из кала (штаммы 1, 5, 9), у 2 — из зева (штаммы 4, 10), у 2 — из крови (штаммы 2, 11), у 1 — из отделяемого конъюнктивы глаза (штамм 12) и у 1 новорожденного из постмортального материала, ткани легкого (штамм 6). Все новорожденные на момент взятия биологического материала имели признаки инфекции (пневмония, сепсис, конъюнктивит), при вскрытии у погибшего ребенка была подтверждена пневмония. Все новорожденные имели низкую и экстремально низкую массу тела.

Посев клинического материала проводили на колумбийский агар (Bio-Rad, США) с добавлением 5 % бараньей крови («ЭкоЛаб», Россия) и маннитно-солевым агаром (Liofilchem, Италия). Чашки инкубировали в термостате при температуре 36–37 °C в течение 48 ч.

Видовую идентификацию выделенных культур осуществляли с помощью метода масс-спектрометрии матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией с времяпролетным анализатором масс (MALDI-TOF MS). Образцы для масс-спектрометрического анализа готовили следующим образом. Суточные культуры микроорганизмов (1–2 колонии) наносили на ячейки стальной мишени, подсушивали в течение 1–2 мин, затем сверху наслаивали 2 мкл насыщенного раствора матрицы. В качестве матрицы применяли альфа-циано-4-гидроксикоричную кислоту (Bruker Daltonics, Германия) в виде насыщенных растворов в смеси 50 % ацетонитрила, 2,5 % трифторуксусной кислоты. Все использованные реактивы, включая воду, были аналитической чистоты или специальными для масс-спектрометрии. Кристаллы оставляли на воздухе в течение 5–10 мин до полного высыхания. Влажность и температуру при этом не контролировали. Каждый образец наносили на стальную мишень в двух повторах, с которых, в свою очередь, снимали масс-спектры в автоматическом режиме. Масс-спектрометрический анализ осуществляли с помощью времяпролетного MALDI масс-спектрометра Autoflex III (Bruker Daltonics, Германия), оснащенного азотным лазером 337 нм. Все измерения проводили в линейном режиме, детектируя положительные ионы. Для накопления масс-спектров мощность лазерного излучения устанавливали на уровне минимального порогового значения, достаточного для десорбции-ионизации образца. Параметры масс-спектрометра оптимизировали для диапазона m/z от 2000 до 20 000. Внешнюю калибровку проводили с использованием точных значений масс известных белков Escherichia coli. Образец наносили на три ячейки стальной мишени, для каждой из которых записывали спектр, полученный в результате суммирования 10 серий измерений по 50 импульсов лазера в каждой. Для записи, обработки и анализа масс-спектров использовали программное обеспечение фирмы Bruker Daltonics (Германия): flexControl 2.4 (Build 38) и flexAnalysis 2.4 (Build 11). Точность измерения масс составляла ± 2 Да. Кластерный анализ, сопоставление получаемых масс-спектров с имеющимися в базах данных производили с помощью программного пакета Biotyper 1.1 (Bruker Daltonics, Германия).

Определение чувствительности штаммов к антибиотикам проводили на автоматическом бактериологическом анализаторе Vitek 2 Сompact (bioMérieux, Франция) по протоколу производителя. Определяли чувствительность штаммов к набору антибиотиков, включавшему бензилпенициллин, цефокситин, гентамицин, клиндамицин, эритромицин, ванкомицин и фузидиевую кислоту. Интерпретацию результатов производили автоматически с помощью программного обеспечения прибора на основании критериев интепретации, рекомендованых EUCAST, 2015 г.

Геномную ДНК выделяли из свежевыращенной культуры путем лизирования лизоцимом и протеиназой К, дальнейшую очистку ДНК проводили при помощи фенолхлороформной экстракции. Для получения библиотек ДНК использовали наборы Ion Xpress Plus Fragment Library Kit и Ion Xpress Barcode Adapters (Thermo Fisher Scientific, США) по протоколу производителя. Качество библиотек проверяли на приборе Agilent 2100 Bioanalyzer system с наборами HighSense DNA Kit (Agilent Technologies, США) согласно протоколу производителя. Для постановки эмульсионной полимеразной цепной реакции (ПЦР) и обогащения сфер использовали наборы Ion OneTouch Template Kit (Thermo Fisher Scientific) согласно протоколу производителя. Секвенирование проводили на платформе Ion PGM Torrent с наборами Ion Sequencing Kit и чипами 316 v1 (Thermo Fisher Scientific) согласно протоколу производителя. Сборку коротких прочтений (ридов) в последовательности большей длины (контиги) осуществляли с помощью программного обеспечения MIRA 3 с использованием параметров genome, de novo, accurate.

Определение сиквенс-типов проводили с помощью программы MLST 1.8 [10]. Использовали результаты анализа полиморфизма по семи локусам: arcC, aroE, gtr, mutS, pyr, tpi и yqiL — проведенного для собранных нуклеотидных последовательностей (контигов). Поиск генов, ассоциированных с резистентностью к антимикробным препаратам, осуществляли с помощью программы ResFinder 2.1 [11]. Минимально допустимая степень сходства составляла 90 %, а минимальная длина перекрытия последовательностей — 70 %. Поиск генов и анализ локусов, ассоциированных с патогенностью, проводили путем анализа соответствующих нуклеотидных последовательностей, полученных из базы данных GenBank [12], с помощью программы BLAST [13].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

У новорожденных ОРИТ НЦАГиП им. В. И. Кулакова выделено 14 штаммов S. epidermidis. Для каждого штамма выполнено полногеномное секвенирование, на основе полученных данных произведено сиквенс-типирование, поиск и анализ генов, ассоциированных с патогенностью штаммов и устойчивостью к антимикробным препаратам. Результаты сборки геномов представлены в табл. 1.

Сиквенс-типирование выявило принадлежность штаммов к восьми сиквенс-типам. Наиболее часто встречались сиквенс-типы ST2 и ST59 (по четыре штамма). Остальные шесть штаммов относились к сиквенс-типам: ST19, ST22, ST87, ST173, ST210, ST218. Штаммов с новыми неизвестными сиквенс-типами обнаружено не было.

Результаты поиска генов резистентности S. epidermidis к антимикробным препаратам представлены в табл. 2 и табл. 3.

Среди штаммов S. epidermidis обнаружены гены резистентности к аминогликозидам aacA-aphD, aadD и aphA. Наиболее распространен ген aacA-aphD, обнаруженный в геномах двенадцати штаммов (штаммы 1–12). Ген aadD встречался в геномах пяти штаммов (штаммы 1, 2, 4, 9, 10), а ген aphA — в геномах двух штаммов (штаммы 3, 7). Считается, что эти гены фенотипически проявляются в наличии устойчивости не ко всему набору антибиотиков из группы аминогликозидов, а только к некоторым антибиотикам данной группы. Согласно данным, опубликованным в последние годы [8], локус aacA-aphD фенотипически проявляется в наличии устойчивости штаммов к амикацину, гентамицину, канамицину и тобрамицину. Ген aadD проявляется в наличии устойчивости к амикацину, канамицину, неомицину и тобрамицину, а ген aphA — в наличии устойчивости к канамицину и неомицину. В нашем исследовании тринадцать штаммов, несущих гены устойчивости, были фенотипически устойчивыми к гентамицину.

Обнаружено два гена, обуславливающих устойчивость к бета-лактамным антибиотикам. Ген blaZ, кодирующий бета-лактамазу, способную расщеплять пенициллины, встречался в геномах всех изученных штаммов. Фенотипически все штаммы были устойчивы к бензилпенициллину. Устойчивость к метициллину у стафилококков определяется геном mecA, который кодирует альтернативный пенициллин-связывающий белок, обладающий пониженным сродством к метициллину [1, 14]. Ген mecA, обуславливающий устойчивость к метициллину, обнаружен у тринадцати штаммов из четырнадцати (штаммы 1–12, 14). При этом фенотипически все четырнадцать штаммов проявляли устойчивость к метициллину (цефокситину), т. е. были метициллин-резистентными.

Из двух известных генов, обуславливающих устойчивость к фузидиевой кислоте, обнаружен только ген fusB, который встречается в геномах шести штаммов (штаммы 2, 4–6, 9, 10). Ген fusC обнаружен не был. При этом фенотипически к фузидиевой кислоте оказались устойчивыми десять штамов из четырнадцати.

В некоторых работах у стафилококков были обнаружены гены vanA, характерные для ванкомицин-устойчивых стафилококков [8]. Однако у наших штаммов генов устойчивости к ванкомицину vanA, vanB и vanZ, а также фенотипически устойчивых к ванкомицину штаммов обнаружено не было.

Фенотипически устойчивость к линкозамидам (клиндамицин) проявлялась у семи штаммов. Обнаружено два гена, ассоциированных с резистентностью к линкозамидам. Ген lnu(A) встречался в геномах четырех штаммов (штаммы 1, 3, 8, 14), а ген vga(B) — у одного штамма (штамм 5). Ген vga(A), который также способен вызвать устойчивость к линкозамидам, обнаружен не был.

Выявлено десять штаммов, фенотипически устойчивых к макролидам (эритромицин). В геномах четырех штаммов (штаммы 6, 7, 11, 12) обнаружен ген msr(A), а в геномах трех штаммов (штаммы 7, 11, 12) — ген mph(C). Эти гены способны вызывать устойчивость бактерий к макролидам, в частности к эритромицину.

Из трех генов, обуславливающих устойчивость штаммов к макролидам и к линкозамидам одновременно [8, 11], в геномах бактерий обнаружено два. Ген erm(C) встречается в геномах шести штаммов (штаммы 1, 3, 7, 8, 10, 14), а ген erm(A) — у одного штамма (штамм 5). Ген erm(B) в геномах не обнаружен.

При лечении заболеваний, вызванных S. epidermidis, применяют ряд антибиотиков, для которых определяется фенотипическая устойчивость штаммов. В ходе работы для таких групп антибиотиков проводили поиск генов устойчивости, а также поиск генов резистентности к антибиотикам из других групп. Обнаружение генов резистентности к препаратам, не применяющимся при лечении заболеваний, представляет несомненный интерес. Во-первых, существует потенциальная возможность горизонтального переноса генов штаммам других видов микроорганизмов с помощью мобильных генетических элементов и плазмид. Во-вторых, анализ наличия/отсутствия таких генов позволяет оценить генетические свойства штаммов.

Ген vat(B), способный вызывать устойчивость к стрептограмину B и, возможно, к линкозамидам [8], обнаружен у одного штамма (штамм 5). Из двух генов, обуславливающих устойчивость стафилококков к тетрациклину, в геномах обнаружен только ген tet(K), встречающийся в четырех штаммах (штаммы 1, 7, 8, 14). Ген tet(M) не обнаружен. У двух штаммов (штаммы 1, 3) показано наличие гена dfr(G), который ассоциирован с устойчивостью к триметоприму. Другой ген устойчивости к триметоприму, dfr(K), в геномах не обнаружен.

Результаты поиска генов S. epidermidis, ассоциированных с патогенностью, представлены в табл. 4.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 

Несмотря на разнообразие сиквенс-типов (восемь разных вариантов), десять штаммов из четырнадцати принадлежали к крупному клональному комплексу CC2. Эти штаммы относились к сиквенс-типам ST2, ST22, ST59 и ST87. По данным научной литературы, ST59 и ST22 относятся к наиболее распространенным в госпиталях сиквенс-типам S. epidermidis [2, 3]. Сиквенс-тип ST2 является родительским для одного из двух главных кластеров (кластер I) клонального комплекса CC2. В многоцентровом исследовании, проведенном M. Miragaia и соавт. в 2007 г. в 18 странах мира, было показано распространение близкородственных штаммов S. epidermidis в госпиталях различных точек мира [3], в 2013 г. аналогичные результаты были получены в России [2]. Эти данные позволяют сделать предположение о наличии у штаммов клонального комплекса CC2 генетических особенностей, позволяющих им длительно циркулировать и персистировать в условиях стационара. Такими свойствами могут быть как повышенная устойчивость к антибиотикам, так и особое сочетание генов антибиотикорезистентности в хромосомных элементах, повышенная способность к образованию биопленок и т. д. Требуется более глубокое изучение популяции штаммов, принадлежащих к CC2, выделенных из клинического материала.

Изученные штаммы стафилококков обладают различным спектром генов резистентности к ряду антимикробных препаратов. Аналогично другим исследованиям [1, 6, 7, 14], разные штаммы включают в себя различный набор генов резистентности. Гены устойчивости к пенициллинам обнаружены у всех четырнадцати (100 %) штаммов, к метициллину — у тринадцати (93 %) штаммов, к аминогликозидам — у двенадцати (86 %), к макролидам — у десяти (71 %), к линкозамидам — у семи (50 %), к фузидиевой кислоте — у шести (43 %), к тетрациклину — у четырех (29 %) и к триметоприму — у двух (14 %) штаммов. Гены устойчивости к ванкомицину не выявлены. Отдельные штаммы содержали от 1 (штамм 13) до 8 (штаммы 1, 7) генов резистентности к антимикробным препаратам каждый.

Следует отметить, что наличие того или иного гена резистентности не свидетельствует о его обязательной экспрессии в количестве, достаточном для фенотипического проявления. Однако в любом случае наличие нуклеотидных последовательностей генов может проявиться фенотипически: либо сразу в виде приобретения устойчивости к тому или иному антимикробному препарату, либо использоваться в качестве исходного материала для эволюционных процессов и возникновения устойчивости к антимикробным препаратам в дальнейшем.

С другой стороны, поиск генов антибиотикорезистентности у штаммов не охватывает все потенциально возможные механизмы резистентности. Известно, что ряд механизмов связан с мутациями собственных генов, и, соответственно, с модификацией или инактивацией собственных ферментов. К примеру, резистентность стафилококков к метициллину может быть связана не только с наличием кассеты mec, но и с модификацией нормального пенициллин-связывающего белка. Кроме того, снижение чувствительности штамма к антибиотикам может быть следствием повышения активности работы эффлюксных помп, выводящих антибиотик из клетки. Отмечены и другие механизмы антибиотикорезистентности. В задачи данной работы не входило проведение анализа нуклеотидных последовательностей генов и их локализации, выявление мутаций, способных повлиять на работу генов, и измерение уровня экспрессии генов. В проведенном исследовании наличие генов резистентности и фенотипическая устойчивость к антибиотикам полностью совпадали в отношении пенициллина, линкозамидов и макролидов. В отношении других антибиотиков фенотипическую устойчивость проявляло, наоборот, большее количество штаммов, чем было обнаружено генов резистентности, что говорит о наличии других механизмов антибиотикорезистентности. Исследования в этой области проводятся в настоящее время.

Таким образом, госпитальные штаммы, выделенные от новорожденных ОРИТ НЦАГиП им. В. И. Кулакова, обладают широким спектром генов резистентности к антимикробным препаратам.

У S. epidermidis существует большое количество генов, ассоциированных с патогенностью. Однако большая часть этих генов выполняет определенные функции и при патогенном, и при комменсальном способе существования S. epidermidis. Поэтому наличие таких генов патогенности у эпидермальных стафилококков не позволяет сделать вывод, является ли данный штамм S. epidermidis патогенным или нет [1, 14, 15]. При этом отмечены определенные корреляции между наличием у штаммов факторов патогенности и особенностями патогенеза госпитальных штаммов [16, 17, 18].

У всех четырнадцати штаммов обнаружены гены aae и atlE. Оба гена кодируют бифункциональные белки, выполняющие как функции аутолизина, так и адгезина, и принимают участие в процессе формирования биопленок. Эти гены широко распространены у S. epidermidis. Другие гены, ассоциированные с патогенностью, встречаются только у части изученных штаммов. Обнаружены штаммы, несущие гены aap, embp, и гены icaA и icaD, входящие в состав ica-оперона. Ген aap кодирует белок Aap, который является наиболее важным фактором, участвующим в белокзависимом пути формирования биопленок. Ген embp также участвует в образовании биопленок, а гены ica-оперона — в синтезе экзополисахаридного внутриклеточного адгезина, который принимает участие как в процессе формирования биопленок, так и в процессах иммунной эвазии.

У ряда штаммов также обнаружен инсерционный элемент IS256, для присутствия которого показано наличие корреляции с патогенностью штаммов [17].

Таким образом, спектр генов, ассоциированных с патогенностью, у разных госпитальных штаммов, выделенных от новорожденных ОРИТ НЦАГиП им. В. И. Кулакова, варьируется. Отдельные штаммы S. epidermidis содержали от 4 (штаммы 1, 3, 5, 7, 11, 12, 13) до 7 (штаммы 8, 14) генов, ассоциированных с патогенностью. Интересно, что в штаммах 1 и 7 обнаружено наибольшее количество генов резистентности, и в то же время эти штаммы содержали минимальное число генов патогенности.

ВЫВОДЫ

Изучен генетический полиморфизм четырнадцати госпитальных штаммов S. epidermidis, выделенных у новорожденных, находившихся на лечении в ОРИТ НЦАГиП им. В. И. Кулакова. Выявлена принадлежность штаммов к восьми разным сиквенс-типам, причем 10 из 14 изученных штаммов принадлежали к крупному клональному комплексу CC2. Обнаружено, что госпитальные штаммы, выделенные у новорожденных ОРИТ НЦАГиП им. В. И. Кулакова, обладают широким спектром генов резистентности к антимикробным препаратам и генов патогенности. У изученных штаммов обнаружено 15 различных генов, обуславливающих резистентность штаммов к аминогликозидам, бета-лактамным антибиотикам, фузидиевой кислоте, макролидам, линкозамидам, стрептограмину B, тетрациклину и триметоприму. Выявлены гены, ассоциированные с патогенностью (aae, atlE, aap, embp, icaA, icaD), встречающиеся в геномах изученных штаммов с разной частотой, а также обнаружен инсерционный элемент IS256.