Процесс терминальной дифференцировки кератиноцитов является одним из возможных путей программируемой клеточной гибели. Он обеспечивает нормальную стратификацию клеток эпидермиса, необходимую для формирования полноценного эпидермального барьера. Нарушения процесса терминальной дифференцировки по той или иной причине лежат в основе формирования клинических проявлений многих хронических заболеваний кожи. Роль белков семейства р53 в регуляции процесса дифференцировки кератиноцитов активно исследуют в последние годы [1–4].
Известно, что белок p53 накапливается и опосредует апоптоз в эпидермисе в ответ на солнечный ожог [5] и ряд других цитотоксических воздействий. Наряду с этим, активные формы белка в большей степени обнаруживаются в пролиферирующих кератиноцитах, но не дифференцированных клетках [6]. Есть мнение, что р53 может играть двойную роль в выживании эпидермиса, поддерживая «здоровые» пролиферативные клетки и вызывая гибель сильно поврежденных [7].
Группа исследователей установила, что p53 стимулирует пролиферацию и замедляет дифференцировку в нормальных кератиноцитах человека путем инактивации сигналинга, опосредованного протоонкогеном MYC [7]. При этом в клетках с нокдауном р53 наблюдали существенное увеличение экспрессии инволюкрина, кератинов KRT1 и KRT10, филаггрина — маркеров клеточной дифференцировки. В целом, для клеток с инактивированным р53 была характерна более высокая скорость стратификации и открепления [7].
Однако специфическая роль белков семейства р53 и их взаимодействие на разных этапах дифференцировки кератиноцитов человека в норме и при патологиях охарактеризованы недостаточно подробно.

В еще меньшей степени исследована роль белков данного семейства в регуляции пролиферации и дифференцировки кератиноцитов линии HaCaT — спонтанно иммортализованных неканцерогенных кератиноцитов человека [8]. Данная клеточная линия получила широкое распространение в качестве модели для изучения функций нормальных кератиноцитов человека [9, 10]. Однако в кератиноцитах линии HaCaT нарушены программа стратификации и экспрессия маркеров дифференцировки [11].
Известно, что в геноме кератиноцитов HaCaT присутствуют две аллели гена TP53 (H179Y и R282Q), которые содержат две gain-of-function (GOV) мутации, приобретённые в результате спонтанной иммортализации (mutp53) [12]. Mutp53 в клетках линии HaCaT обладает выраженной активностью в отношении увеличения скорости пролиферации и роста клеток и имеет более 7000 сайтов связывания с ДНК. При этом связанные с запуском апоптоза функции белка сохранены [4].
Кроме того, в отличие от нормальных кератиноцитов, клетки линии НaCaT преимущественно экспрессируют ΔNα изоформу p63, а изоформа TA практически не детектируется [13].

Понимание особенностей физиологии клеток НaCaT и лежащих в их основе молекулярных механизмов необходимо для оценки ограничений при использовании таких клеток в качестве модельных. Кроме того, изучение особенностей взаимодействия белков семейства p53 в условиях присутствия в геноме клеток mutp53 позволит получить новые данные, актуальные для исследования канцерогенеза [14, 15].
Целью настоящего исследования было изучить регуляторную роль белков семейства р53 в процессах пролиферации и дифференцировки клеток линии HaCaT. В ходе исследования осуществляли модуляцию белка р53: активацию обеспечивали путем воздействия Nutlin-3a (блокатор MDM2, основного негативного регулятора р53), а для подавления экспрессии р53 применяли anti-TP53 shRNA.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные линии и условия культивирования

Клеточная линия HaCaT была приобретена в коллекции клеточных культур German Cancer Research Center (DKFZ, Heidelberg; Германия). Клетки культивировали при 37 °С и 5% СО₂ в среде DMEM/F12 (1:1, Gibco; США) с добавлением 1% GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific; США), раствора пенициллина/стрептомицина в концентрации 100 ед./мл и 100 мкг/мл соответственно (Gibco; США) и 10% эмбриональной бычьей сыворотки («Диа-М»; Россия) — полная культуральная среда. Клетки выращивали в культуральных флаконах площадью 25 см² или в чашках Петри диаметром 60 мм (Corning; США). Среду заменяли на свежую через каждые 48 ч культивирования.

Нокдаун гена TP53 с помощью shRNA

Для нокдауна гена TP53 использовали лентивирусный вектор, который кодирует anti-TP53 shRNA. Для сборки лентивирусного вектора клетки линии HEK2937T трансфицировали вектором pLKO-p53-shRNA (Addgene, #25637), используя стандартный протокол для трансфекции с помощью полиэтиленимина (PEI) [16]. Кондиционная среда, содержащая лентивирусные частицы, была собрана спустя 48–72 ч культивирования после трансфекции. Для увеличения эффективности трансдукции в среду с лентивирусными частицами добавляли сульфат протамина (50 мкг/мл). Для трансдукции кератиноциты линии HaCaT выращивали до конфлюентности 40–50%, после чего среду культивирования заменяли на среду с лентивирусными частицами. Далее клетки центрифугировали при 800g в течение 1,5 ч. По завершении центрифугирования кондиционную среду заменяли на полную культуральную среду. В качестве контрольной линии для селекции с пуромицином использовали клетки дикого типа (WT HaCaT), трансдуцированные вектором lego-ig2 (Addgene #27341), не содержащим ген устойчивости к пуромицину. После трансдукции клетки обеих линий (контрольной и экспериментальной) культивировали при 37 °С и 5% СО₂ в течение 4 суток, после чего заменяли среду на содержащую пуромицин (1 мкг/мл) и культивировали до гибели 100% клеток контрольной линии. За это время также погибали нетрансдуцировавшиеся клетки в экспериментальной группе.

Определение уровня экспрессии генов

Клетки выращивали в 60 мм чашках Петри в полной культуральной среде при 37 °С и 5% СО₂. По достижении 60% конфлюентности среду культивирования заменяли на содержащую Nutlin-3a (Merck; Германия). Клетки инкубировали в течение 24 ч и использовали для дальнейших экспериментов.
РНК выделяли с помощью набора RNeasy Kit (QIAGEN; США) согласно протоколу производителя. Количество полученной РНК измеряли на приборе NanoDrop 2000c (Thermo Scientific; США). Для проведения реакции обратной транскрипции использовали коммерческий набор MMLV RT («Евроген»; Россия) по стандартному протоколу, добавляя в реакцию по 1 мкг РНК. ПЦР в реальном времени (qPCR) проводили, используя реакционную смесь qPCRmix-HS SYBR+LowROX («Евроген»; Россия). Для каждой группы использовали три биологических образца, для каждого гена и каждого образца реакцию проводили в трех повторах. В качестве референсного гена использовали GAPDH. Используемые праймеры представлены в таблица.

Определение метаболической активности

Определение метаболической активности клеток было проведено с помощью МТТ-анализа [17]. Клетки рассаживали в 96-луночный планшет (Corning; США) из расчета 3,0 × 103 клеток на лунку за 48 ч до воздействия, 6 лунок для каждой концентрации Nutlin-3a. Спустя двое суток культивирования среду заменяли на свежую среду, содержащую Nutlin-3a в концентрациях 0,2–50 мкМ, и инкубировали клетки в течение 24 ч. По завершении культивирования среду заменяли на свежую среду, содержащую МТТ («Диа-М»; Россия) в концентрации 1 мг/мл.
Клетки инкубировали 2 ч, образовавшиеся гранулы формазана растворяли в ДМСО (Helicon; Россия). Затем проводили измерение оптической плотности при длине волны 490 нм. Эксперимент проводили в трех независимых биологических повторах.

Иммуноферментный анализ

Для полуколичественного определения уровня р53 использовали коммерческий набор ab205713 (Abcam; Великобритания) в соответствии с руководством производителя. Клетки рассаживали в 96-луночный планшет в трех повторах в плотности 1 × 104 клеток на лунку. Интенсивность сигнала измеряли с помощью спектрофотометра iMark (Bio-Rad; США) на длине волны 450 нм.

Иммунофлуоресцентное окрашивание

Для иммунофлуоресцентного окрашивания клетки культивировали на покровных стеклах в 6-луночных планшетах. Клетки фиксировали в 4%-м формалине, пермеабилизовали 0,1% Тритоном Х-100, окрашивали первичными антителами к ΔNp63 (#619002, Biolegend; США), ТAр63 (#618902, Biolegend; США), KRT5 (ab52635, Abcam; Великобритания), KRT10 (ab9025, Abcam; Великобритания) и вторичными Alexa Fluor 488-конъюгированными (ab150105, Abcam; Великобритания) или Texas Red- конъюгированными (ab6793, Abcam; Великобритания) антителами. Все препараты подвергали окрашиванию одновременно, используя один и тот же набор реактивов (разведений антител и буферов). Эксперимент проводили в трех независимых биологических повторах.
Полученные препараты последовательно визуализировали с помощью лазерного конфокального микроскопа LSM 710 (Carl Zeiss; Германия) с использованием одинаковых настроек. Для каждого препарата фотографировали не менее 5 полей зрения. Обработку фотографий проводили в программе CellProfiler 3.1.9 [18]. Анализировали не менее 100 клеток для каждого образца, вычисляли среднюю интенсивность флуоресценции (интенсивность флуоресценции клетки, поделенная на площадь клетки). Значения средней интенсивности флуоресценции нормировали на значение средней интенсивности флуоресценции в контрольной группе.

Анализ данных

Для анализа использовали данные, полученные от трёх биологических повторов. Результаты обрабатывали с помощью языка программирования для статистической обработки данных R [19]. Межгрупповые различия величин анализируемых параметров определяли с помощью t-критерия Стьюдента с поправкой Бенджамини–Хохберга на множественное сравнение. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05. Данные представлены в виде M ± m.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение линии HaCaT c нокдауном TP53 подтверждали с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Трансдукция anti-TP53 shRNA приводила к значительному (в 2,2 раза, p < 0,05), но не полному снижению внутриклеточной концентрации p53 (ИФА) (рис. 1А).
Метаболическую активность клеток дикого типа и клеток с нокдауном ТР53 в условиях воздействия ингибитора активности MDM2, Nutlin-3a оценивали с помощью МТТ-теста (рис. 1Б). Воздействие Nutlin-3a в течение 24 ч приводило к дозозависимому снижению количества образовавшегося формазана в клетках линии HaCaT дикого типа. Значения IC10 и IC50 составили 0,18 ± 0,10 мкМ и 129,11 ± 167,78 мкМ соответственно.
Такое же экспериментальное воздействие на клетки с нокдауном ТР53 не влияло на продукцию формазана. Значимые различия в продукции формазана данными клетками в сравнении с клетками дикого типа наблюдали при воздействии Nutlin-3a в концентрации 10 мкМ и выше. В связи с этим для дальнейших экспериментов использовали Nutlin-3a в концентрации 10 мкМ.
Выявленные особенности влияния Nutlin-3a на метаболическую активность клеток с нокдауном ТР53 могут быть связаны со значительным снижением в таких клетках содержания активных форм p53. При этом блокирование MDM2-зависимой деградации р53, обусловленное Nutlin-3a, по-видимому, не приводит к повышению его концентрации, достаточному для реализации основных эффектов p53 (остановка клеточного цикла, апоптоз).
Экспрессия генов ряда белков, отражающая активность процессов дифференцировки кератиноцитов, в интактных клетках дикого типа и клеток с нокдауном TP53 различалась (рис. 2A). Так, по сравнению с клетками дикого типа в клетках с нокдауном была отмечена более высокая экспрессия генов, кодирующих инволюкрин и каспазу 14, в то же время экспрессия гена TGM1 была ниже. Значимых различий в уровне экспрессии цитокератинов (ПЦР, флуоресцентная микроскопия) зарегистрировано не было (рис. 2A, Б, В).
Кроме того, в клетках с нокдауном была снижена экспрессия генов, кодирующих изоформы р63, ΔNp63 и ТAр63. Также наблюдалось снижение количества указанных белков в цитоплазме и ядре (микроскопия) (рис. 3A, Б).
Воздействие Nutlin-3a на клетки дикого типа приводило к увеличению активности гена Р21 в два раза, что свидетельствует о накоплении в клетках активных форм р53. При этом было зарегистрировано увеличение экспрессии гена ТGM1, гена, кодирующего синтез изоформы p63 (ΔNp63), незначительное увеличение экспрессии IVL, уровень которого, однако, оставался существенно более низким, чем в клетках с нокдауном. В то же время достоверных изменений уровня CASP14 и экспрессии цитокератинов 14 и 10 (ПЦР) выявлено не было. Данные по экспрессии цитокератина 10 подтверждены данными микроскопии. При этом было зарегистрировано увеличение в 1,54 раза содержания цитокератина 5 (микроскопия). Интересно, что наряду с увеличением экспрессии ΔNp63, наблюдалось уменьшение количества этого белка как в ядре, так и в цитоплазме клеток. При этом количество ТAр63 в ядре и цитоплазме клеток увеличивалось.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Настоящее исследование направлено на изучение особенностей влияния белков семейства р53 на процесс дифференцировки кератиноцитов линии HaCaT. При этом было изучено изменение экспрессии маркеров дифференцировки в зависимости от активности р53: снижения экспрессии р53 достигали за счет нокдауна ТР53, а увеличения активности белка — за счет добавления в культуральную среду Nutlin-3a.
В качестве маркеров дифференцировки кератиноцитов были выбраны белки, экспрессия которых увеличивается в нормальных кератиноцитах по мере продвижения клеток эпидермиса от базального слоя к роговому (IVL, TGM1 и CASP14). Так, инволюкрин (IVL) является представителем структурных белков кератиноцитов, обеспечивающих механическую прочность эпидермального барьера. Кроме того, комплексы инволюкрина с липидами (омега- гидроксицерамидами) участвуют в формировании водонепроницаемой нерастворимой оболочки клеток рогового слоя эпидермиса [20]. Инволюкрин является одним из основных субстратов трансглутаминазы 1 типа (TGM1), которая катализирует образование поперечных связей между остатками лизина в структурных белках эпидермиса [21]. TGM1 имеет критическое значение при формировании эпидермального барьера [21]. Каспаза 14 (CASP14), в отличие от других белков данного семейства, специфически экспрессируется в эпидермисе, практически не участвует в реализации апоптоза, но при этом является регулятором дифференцировки кератиноцитов [22].

Для оценки степени дифференцированности клеток также исследовали экспрессию кератинов — KRT10, KRT5, KRT14 (компоненты белков промежуточных филаментов цитоскелета кератиноцитов). Известно, что высокое содержание KRT1 и KRT10 наиболее характерно для дифференцирующихся кератиноцитов [23], в отличие от кератинов KRT5 и KRT14, активно экспрессирующихся в клетках базального слоя эпидермиса [24].
В тех же экспериментальных условиях оценивали экспрессию других членов семейства р53, ΔNp63 и ТAр63, что позволило оценить ее зависимость от активности р53.
Ранее было проведено исследование влияния снижения экспрессии р53 (в результате нокдауна ТР53) на экспрессию маркеров дифференцировки нормальных кератиноцитов человека [7]. Таким образом, сопоставление экспериментальных данных с данными литературы, возможно, позволит получить информацию о сходстве и различии влияния белков семейства р53 на процесс дифференцировки в нормальных кератиноцитах и клетках линии HaCaT.
Следует отметить, что в ходе настоящего исследования не было достигнуто полное подавление экспрессии p53 в клетках HaCaT. Это может быть связано с устойчивостью клеток этой линии к действию реагентов для трансдукции/ трансфекции (в сравнении с клетками эпителия внутренних органов) [25]. Однако снижение экспрессии p53 было значительным (в 2,2 раза).

Среди исследованных нами маркеров дифференцировки кератиноцитов, в большей степени ассоциированными с изменением экспрессии p53, оказались гены IVL, CASP14 и TGM1. Наиболее зависимой от активности р53 оказалась экспрессия гена TGM1: величина этого показателя значимо снижалась в клетках с нокдауном ТР53 и возрастала при воздействии Nutlin-3a.
Следует отметить, что уровень экспрессии TGM1 и инволюкрина, белка, являющегося субстратом для TGM1, а также динамика изменения величин указанных параметров в исследованных экспериментальных ситуациях не совпадали. Экспрессия инволюкрина значительно возрастала в клетках с нокдауном ТР53, но также возрастала, хоть и в меньшей степени, при воздействии Nutlin-3a. Вероятно, несмотря на очевидную функциональную взаимосвязь TGM1 и инволюкрина, регуляция их экспрессии в клетках HaCaT различается.
В отличие от нормальных кератиноцитов, не реагирующих изменением экспрессии р63 в ответ на нокдаун р53 [7], в нашем исследовании модуляция активности р53 в клетках HaCaT приводила к изменению экспрессии изоформ р63. Ранее о снижении экспрессии ТР63 в клетках HaCaT с нокдауном р53 также сообщили [4].

Известно, что изоформы p63, в особенности ΔNp63, являются ингибиторами активности р53 [1]. Нельзя исключить, что высокая базовая экспрессия ΔNp63 в клетках HaCaT направлена на инактивацию эффектов mutp53. В этой связи зарегистрированное нами изменение соотношения р53 и изоформ р63 (ΔNp63, ТAр63) в клетках с нокдауном ТР53 по сравнению с интактными клетками представляется закономерным — в отсутствие белка, функцию которого необходимо ингибировать (р53), наблюдается снижение экспрессии изоформ р63. Отмеченное нами противоречие в динамике экспрессии ΔNp63 при воздействии Nutlin-3a (рост экспрессии по данным исследования методом ПЦР наряду с уменьшением количества белка в цитоплазме и ядре клеток) может представлять собой результат участия белка ΔNp63 в инактивации р53, например, в результате образования гетеродимеров ΔNp63/р53 [26].
В то же время увеличение количества белка ТAр63 в клетках без значимого изменения уровня экспрессии кодирующего данный белок гена в той же экспериментальной ситуации может быть связано с ингибированием активности MDM2. Согласно данным литературы [27], а также полученным нами данным, MDM2 может быть негативным регулятором активности не только р53, но и ТAр63.

Известно, что по мере продвижения кератиноцитов от базального слоя к выше расположенным слоям активность р53 увеличивается, в том числе из-за постепенного снижения ингибирующего влияния ΔNp63. В результате р53 реализует свои функции, необходимые для завершения процесса кератинизации. В частности, он обеспечивает экспрессию TGM1, субстрат для которого (инволюкрин) нарабатывается в более низких слоях эпидермиса под влиянием иных регуляторных механизмов.
Нельзя исключить, что основным регулятором экспрессии TGM1 в клетках HaCaT является не р53 непосредственно, а белок ΔNp63. Как видно, динамика изменения экспрессии гена, кодирующего данный белок, является однонаправленной с изменениями экспрессии гена, кодирующего TGM1. Причем это изменение экспрессии ΔNp63 очевидно было связано с изменением активности р53 в клетках.

Очевидно влияние активности р53 в клетках HaCaT на экспрессию другого маркера дифференцировки кератиноцитов — каспазы 14. В клетках с нокдауном ТР53 экспрессия кодирующего СASP14 гена значительно возрастала. По-видимому, в клетках НaCaT р53 прямо или косвенно эффективно ингибирует экспрессию этого белка. При этом активность такого воздействия достаточно высока — увеличение активности р53 в результате действия Nutlin-3a на клетки не приводило к значимому снижению экспрессии СASP14.

Следует отметить, что в условиях модуляции активности р53 в клетках НaCaT не возникали значимые изменения экспрессии цитокератинов. Исключение составил KRT5 — маркер клеток в составе низкорасположенных слоев эпидермиса. Его экспрессия незначительно возрастала при воздействии Nutlin-3a, по-видимому, в результате активации эффектов mutр53, способствующих пролиферации клеток [4]. Экспрессия KRT10, характерная для дифференцирующихся кератиноцитов [23], в клетках с нокдауном р53 не менялась. При этом угнетение функции р53 в нормальных кератиноцитах сопровождается увеличением экспрессии указанных цитокератинов [7]. В клетках НaCaT mutр53 обладает выраженным ингибирующим действием на экспрессию этих белков, которое сохраняется в условиях неполного нокдауна ТР53.

ВЫВОДЫ

В условиях модуляции активности р53 в клетках линии HaCaT меняется экспрессия отдельных маркеров дифференцировки клеток — в частности, каспазы 14, инволюкрина и трансглутаминазы-1, но не кератина KRT10. В отличие от нормальных кератиноцитов человека, клетки HaCaТ реагируют на уменьшение активности p53 снижением экспрессии изоформ р63. Результаты настоящего исследования могут быть приняты во внимание при исследовании процессов, связанных с дифференцировкой кератиноцитов, и использовании линии HaCaT в качестве клеточной модели кожи. Полученные данные позволяют более детально оценить роль экспрессируемых линией HaCaT белков семейства р53 в различных физиологических процессах.